论文部分内容阅读
本研究致力于开发高效的药物蛋白表达系统和具有环境保护功能的转基因藻种，由于叶绿体表达系统在Bt毒蛋白及几种药物蛋白表达中表现出非常高的效率，选择了模式生物莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的叶绿体作为外源蛋白的表达系统。同时由于蓝藻与叶绿体在进化上的同源性，也将叶绿体载体中的多顺反子策略引入到蓝藻表达载体构建中来。选择了两个本实验室研究较为深入的低分子量蛋白编码基因，分别在衣藻叶绿体及蓝藻中进行了表达。一种是定位在人胃肠道中表达的人小肠三叶因子(HumanTrefoilFactor3，hTFF3)，被认为具有保护胃肠道粘膜及促进损伤修复的作用，并且对酸、热、多种蛋白酶稳定。将一种更加稳定的TFF3突变体NTF1的编码基因转入衣藻叶绿体及蓝藻中表达，此项研究是为了获得具有治疗胃溃疡作用的功能型保健食品。人金属硫蛋白2(hMT2)是转入衣藻叶绿体中表达的另外一种蛋白，它富含半胱氨酸，在金属代谢及抗氧化等许多方面发挥重要作用。衣藻自身就具有较高的重金属吸附能力，将根据衣藻质体主要蛋白密码子偏爱性改造后的MT2基因转入衣藻的质体中表达，我们期望能够进一步提高藻拮抗和吸附重金属的能力，用于工业废水的治理。
本文构建了两种类型的质体表达载体来实现MT2基因在农藻质体中的表达。两种载体中应用的筛选标记基因都是aadA(aminoglycoside3adenylyltransferase)，它的编码产物赋予转基因藻壮观霉素和链霉素的抗性。在多顺反子表达载体pCS-MT-1中，MT2与aadA串连成为人工的多顺反子结构，由共同的衣藻叶绿体强启动子PpsbA和终止子TrbcL调控；在独立表达盒载体pCS-MT-2中，两个基因是分别由各自的启动子、终止子调控表达的。PCR反应鉴定了目的基因的整合及转基因藻的同质化状态，Westernblotting实验证实了MT在转基因藻中得到表达，竞争型ELISA测得MT2在转基因藻中最高表达量为2﹪。由于外源DNA的插入破坏了衣藻质体基因组中叶绿素酸酯还原酶的编码基因chlL，转基因藻在长时间黑暗培养后因无法合成叶绿素而呈现黄色，而野生藻仍然保持绿色。转基因藻在高盐培养基中倾向于形成四聚体。在一系列含不同浓度、不同种类金属离子的培养基中培养质体转MT2基因的衣藻，发现转基因藻对镉的耐受能力明显提高，而在含铜和锌的培养基中与野生藻的生长状况相似。同时，转基因藻清除培养基中镉和铜的能力高于野生藻。UV-B处理过程中，转MT2基因衣藻的叶绿素含量保持小幅度上升，而野生藻培养物的叶绿素含量持续下降。
采用与pCS-MT-1完全相同的调控元件，作者构建了NTF1基因的多顺反子型表达载体pCS-NTF1，基因枪轰击转化后经多轮抗生素筛选得到同质化转基因衣藻。分别用针对NTF1基因和来自衣藻质体基因组的整合平台片段设计的两种引物进行PCR反应，证实了外源基因的整合和转基因藻已经达到同质化状态。Westernblotting检测到了NTF1的表达。与MT2转基因藻相似，转NTF1基因的衣藻在黑暗中培养一段时间后也呈现黄色，这可以作为同质化成功的证明。与转MT2基因衣藻不同的是NTF1转基因藻在低盐TAP培养基中倾向于形成四聚体，而在高盐培养基中则保持单细胞状态。而且转NTF1基因衣藻在TAP培养基中的单细胞呈现正圆形，细胞体积约为椭圆型的野生藻的1.5～2倍。
此外，还将这种多顺反子的策略引入到蓝藻表达载体的构建中来，将编码人小肠三叶因子突变体的基因NTF1与壮观霉素/链霉素抗性基因aadA前后串联，并由共同的衣藻atpA基因启动子与rbcL基因终止子调控，构建成为多顺反子的整合型蓝藻表达载体pKGA-NTF1，通过自然转化的方法将目的基因整合到聚球藻7002(Synechococcussp.PCC7002)基因组中。下游aadA基因的成功表达使大肠杆菌和蓝藻细胞可以抵抗高浓度的壮观霉素，提高了转化子的筛选效率。PCR检测证实了外源基因的整合。Westernblotting检测到了NTF1在聚球藻中的表达。此外，作者还对这种蓝藻多顺反子表达载体进行了改进，即由高等植物绿穗苋(Amaranthushybrids)叶绿体的强启动子PpsbA替换中等强度的PatpA，并将大肠杆菌pET30a载体中的组氨酸标签引入到蓝藻表达载体中，目的是便于外源基因的纯化。这种载体被命名为pUGA-NTF1，实验证明也可以在蓝藻中实现外源基因的表达。两种载体上的多克隆位点便于目的基因及表达元件的替换，操作简便快捷，为基础理论研究及实际应用提供了一类新型高效的蓝藻表达载体构建模式。
如上所述，构建了一系列的质体及蓝藻表达载体，以其实现药物蛋白在绿色生物中的高效表达，但是两种低分子量蛋白的表达效率都没有获得文献报道中那样激动人心的高表达量，这可能与蛋白自身性质有关。质体系统表达人源蛋白还处于初级的研究阶段，我们的研究为此项探索提供了参考，而且两种蛋白在质体中的表达都引起了转基因衣藻表型的变化，也为农藻生理生化代谢的研究提供了突变表型。