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本文对氟非尼酮抑制肝星状细胞增殖机制进行了研究。本研究分为四个部分： 第一章：氟非尼酮对肝纤维化的疗效观察。 背景：肝纤维化是各种肝病进展到肝硬化的中间阶段。目前认为，肝纤维化有完全逆转的可能。如何防治肝纤维化是目前肝脏病领域的研究热点之一。然而到目前为止，临床试验尚未发现能够完全阻止肝纤维化进展的药物，因此，治疗肝纤维化的新药研究亟待开展。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)增多是肝纤维化的主要病理特征。肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)是产生ECM的主要细胞，在肝纤维化中发挥重要的作用。研究发现，HSC的增殖在肝纤维化的发生发展中发挥重要作用，是治疗肝纤维化的关键。氟非尼酮(1-(3-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮，fluorofenidone，AKF-PD）是本课题组合成得到的一种新的吡啶酮类化合物，已获得2项国家发明专利。在前期的研究中发现AKF-PD可以抑制肝、肾纤维化，本实验将进一步验证AKF-PD对肝纤维化的疗效。 目的：观察AKF-PD对二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)诱导的大鼠肝纤维化肝组织炎症评分、纤维化评分、Ⅰ、Ⅲ型胶原以及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达的影响，进一步验证AKF-PD对肝纤维化的疗效。 方法：以DMN诱导大鼠肝纤维化模型。Wistar大鼠（144只）随机分为正常组和DMN模型组。造模2周后，各组随机处死大鼠12只，分别行HE和Masson染色，观察肝纤维化模型成模情况。余下的模型组再随机分为DMN模型组、AKF-PD治疗组、吡非尼酮(Pirfenidone，PFD)治疗组;继续造模1周，同时从第三周造模开始予以各种药物治疗。治疗4周后留取肝组织标本，分别行HE和Masson染色观察大鼠纤维化成模情况及药物疗效，行免疫组化观察Ⅰ，Ⅲ型胶原的表达，Western blot检测α-SMA的表达。 结果：⑴给予DMN腹腔注射2周后，模型组大鼠肝组织炎症评分及纤维化评分与正常组相比明显升高p＜0.05），表明造模成功。⑵继续造模1周，同时药物治疗4周后，DMN模型组大鼠肝组织炎症评分、纤维化评分、Ⅰ，Ⅲ型胶原以及α-SMA表达与正常组相比明显升高(p＜0.05);与模型组相比，AKF-PD及PFD治疗后，能显著改善DMN模型组大鼠肝组织炎症评分、纤维化评分，减少Ⅰ，Ⅲ型胶原以及α-SMA的表达(p＜0.05)。 结论：①AKF-PD具有治疗肝纤维化的作用。②AKF-PD能抑制肝星状细胞的活化和增殖，从而减少细胞外基质形成，有效减轻病变肝脏纤维化程度，提示抑制肝星状细胞的活化和增殖是AKF-PD治疗肝纤维化的机制之一。 第二章：大鼠原代肝星状细胞的分离，培养及鉴定。 背景：肝纤维化是各种肝病进展到肝硬化的中间阶段。目前认为，肝纤维化有完全逆转的可能。肝纤维化的病理特征为细胞外基质增多。肝星状细胞是产生ECM的主要细胞，在肝纤维化中发挥重要的作用。原代肝星状细胞较永生型肝星状细胞株更适合于肝纤维化发病机制的研究。本实验将从正常SD大鼠体内分离原代肝星状细胞，并进行培养，鉴定，以进行肝纤维化发病机制方面的研究。 目的：从正常SD大鼠肝脏中分离原代肝星状细胞，并进行培养，鉴定。 方法：采用CollagenaseⅣ+Pronase肝脏原位灌注法从正常SD大鼠肝脏中分离原代肝星状细胞（11.3％Nycodenz梯度离心）。并进行体外培养，于荧光显微镜下进行荧光鉴定。同时采用免疫组化的方法，检测结蛋白(Desmin)，α-SMA的表达，对HSC进行鉴定。 结果：⑴采用CollagenaseⅣ+Pronase肝脏原位灌注法从正常SD大鼠肝脏中成功分离原代肝星状细胞，并在37℃，5％CO2的培养箱中成功培养。⑵分离后第2天，在荧光显微镜下观察到，HSC于328nm处自发蓝绿色荧光，为HSC逐渐活化的表现。⑶分离后10-14天，HSC已完全活化，具备肌成纤维细胞(myofibroblast)的特性，表达特征性的结蛋白和α-SMA。 结论：成功进行大鼠原代肝星状细胞的分离，培养及鉴定。 第三章：氟非尼酮对肝星状细胞增殖的影响及作用机制研究。 背景：氟非尼酮是本课题组合成得到的一种新的吡啶酮类化合物，已证明其具有较强的抗肝纤维化作用。目前AKF-PD抗肝纤维化的机制还不十分明确，本课题组前期的研究结果显示:AKF-PD能抑制肝星状细胞的增殖，而不影响其凋亡。第一章的研究结果显示，AKF-PD能抑制肝星状细胞的活化和增殖，从而减少细胞外基质形成，有效减轻病变肝脏纤维化程度，提示抑制肝星状细胞的活化和增殖是AKF-PD治疗肝纤维化的机制之一。本实验将观察AKF-PD在体外对肝星状细胞活化和增殖的影响，并探讨其作用机制。 目的：在体外水平观察AKF-PD对HSC增殖的影响;观察AKF-PD对HSC细胞周期的影响;探讨AKF-PD抑制肝星状细胞增殖的作用机制。 方法：⑴以PDGF（10ng/ml）刺激HSC细胞，以AKF-PD不同浓度（1mM，2mM）作用HSC细胞24，48小时，MTT法检测HSC细胞增殖。⑵以AKF-PD不同浓度(1mM，2mM)作用HSC细胞48小时，PI流式细胞法检测细胞周期。⑶以PDGF（10ng/ml）刺激HSC细胞建立肝星状细胞增殖模型。分为正常组，PDGF刺激组，PDGF+AKF-PD(2mM)组，PDGF+PFD（2mM）组，药物预处理24小时后加入PDGF(10ng/ml)继续培养24小时，采用Western blot检测α-SMA、Ⅰ型胶原、cyclin D1、cyclin E、p27kip1的表达。⑷将HSC细胞分为正常组，单独AKF-PD（2mM）组，PDGF刺激组，PDGF+AKF-PD(2mM)组，抑制剂组，PDGF+PFD(2mM)组，然后用AKF-PD(2mM)和PFD(2mM)预处理HSC细胞24小时，在提取蛋白前15分钟加入PDGF（10ng/ml），采用Western blot检测p-ERK、p-MEK、p-Akt(S473,T308)和p-p70s6K的表达。 结果：①PDGF（10ng/ml）刺激HSC，AKF-PD不同浓度(1mM，2mM)作用HSC细胞24，48小时后，HSC的增殖被不同程度的抑制，抑制作用随着AKF-PD浓度的增加和作用时间的延长而增强。②AKF-PD不同浓度(1mM，2mM)作用HSC细胞48小时，PI流式细胞法检测，HSC被AKF-PD阻滞在细胞生长的G1期。阻滞作用随着AKF-PD浓度的增加而增强。③PDGF刺激HSC细胞24小时后，α-SMA(p＜0.05)、Ⅰ型胶原(p＜0.05)、cyclin D1(p＜0.05)以及cyclin E的表达(p＜0.05)显著上调，p27kip1的表达显著下调(p＜0.05)。AKF-PD和PFD治疗后能够显著抑制α-SMA(p＜0.05)、Ⅰ型胶原(p＜0.05)、cyclin D1(p＜0.05)以及cyclin E的表达(p＜0.05)，上调p27kip1的表达(p＜0.05)。AKF-PD(2mM)组的治疗效果与同等剂量的PFD组相当(p＞0.05)。④PDGF刺激HSC细胞15分钟后，p-ERK、p-MEK、p-Akt(S473，T308)和p-p70S6K的表达均显著上升，AKF-PD和PFD能有效减少ERK、MEK、Akt(S473，T308)和p70S6K的磷酸化(p＜0.05)。AKF-PD(2mM)组的治疗效果与同等剂量的PFD组相当(p＞0.05)。 结论：⑴AKF-PD具有抑制活化的肝星状细胞增殖的作用。⑵AKF-PD能阻滞活化的肝星状细胞的细胞周期。⑶AKF-PD抑制活化的肝星状细胞增殖的疗效与同等剂量的PFD相当。⑷AKF-PD抑制肝星状细胞增殖可能是通过抑制ERK/MAPK及PI3K/Akt信号通路。 第四章：氟非尼酮抑制肝星状细胞增殖的作用靶点。 背景：氟非尼酮是本课题组合成得到的一种新的吡啶酮类化合物，已证明其具有较强的抗肝纤维化作用。目前AKF-PD抗肝纤维化的机制还不十分明确，第三章的研究结果显示AKF-PD抑制肝星状细胞增殖可能是通过抑制ERK/MAPK及PI3K/Akt信号通路。然而AKF-PD在这两个信号通路中的作用靶点还不确切。本章实验将观察AKF-PD在ERK/MAPK及PI3K/Akt信号通路中的作用靶点，进一步明确其作用机制。 目的：在体外水平观察AKF-PD在ERK/MAPK及PI3K/Akt信号通路中的作用靶点;观察AKF-PD通过作用靶点对HSC细胞Ⅰ型胶原及细胞周期调节蛋白cyclin D1表达的影响，探讨AKF-PD抑制肝星状细胞增殖的作用机制。 方法：⑴以脂质体法转染持续活化ERK的质粒MEK-Q56P入HSC，AKF-PD(2mM)作用HSC24小时，采用Western blot方法检测p-ERK1/2; AKF-PD(2mM)作用HSC48小时，采用Western blot方法检测Ⅰ型胶原及cyclin D1的表达。⑵以脂质体法转染持续活化PI3K的质粒PI3KP110α-CAAX入HSC，AKF-PD(2mM)作用HSC24小时，采用Westernblot检测p-Akt; AKF-PD(2mM)作用HSC48小时，采用Westem blot方法检测Ⅰ型胶原及cyclin D1的表达。 结果：①转染持续活化ERK的质粒MEKQ56P入HSC后，p-ERK1/2(p＜0.05)、Ⅰ型胶原(p＜0.05)及cyclin D1的表达(p＜0.05)显著上调，AKF-PD治疗后能够显著抑制ERK的磷酸化(p＜0.05)，抑制Ⅰ型胶原(p＜0.05)以及cyclin D1的表达(p＜0.05)。②转染持续活化PI3K的质粒PI3K P110α-CAAX入HSC后，p-Akt(p＜0.05)、Ⅰ型胶原(p＜0.05)及cyclin D1的表达(p＜0.05)显著上调，AKF-PD治疗后能够显著抑制Akt的磷酸化(p＜0.05)，抑制Ⅰ型胶原(p＜0.05)以及cyclin D1的表达(p＜0.05)。 结论：⑴AKF-PD通过ERK/MAPK信号通路抑制肝星状细胞增殖，其作用靶点在ERK。⑵AKF-PD通过PI3K/Akt信号通路抑制肝星状细胞增殖，其作用靶点在Akt。