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背景和目的隐球菌病主要是由新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)和格特隐球菌(Cryptococcus gattii)感染引起的一种重要的、能危及生命的真菌感染性疾病。该菌是一种含荚膜的酵母样致病真菌,广泛存在于自然界。美国传染病学会2010年更新的隐球菌病临床实践指南推荐两性霉素B、5-氟胞嘧啶和唑类药物治疗隐球菌病。唑类药物的抑菌特性使得唑类药物的运用必须是一个长期维持的过程,这就导致唑类药物耐药株的出现。此外,隐球菌可在一定条件下形成生物膜,生物膜能保护真菌细胞免受自然界或宿主的伤害,并增强真菌细胞对抗真菌药物的抵抗性。因此,隐球菌病的治疗仍旧面临挑战。氨溴索为溴已新的体内活性代谢产物,是一种黏液溶解剂及肺表面活性物质合成激活剂,其祛痰作用广泛用于呼吸系统疾病。近年来,氨溴索的非核准标示外应用也得到了广泛关注。研究表明该药对多种病原体有一定抑制作用。本实验旨在研究氨溴索对隐球菌浮游细胞和成熟生物膜的抗真菌活性。方法本研究所用隐球菌临床分离株分离自我南京军区南京总医院,经分子生物学鉴定方法将隐球菌菌株鉴定到基因型;使用隐球菌标准株7株,分别为新生隐球菌格鲁比变种H99(血清型A),新生隐球菌新生变种B3501(血清型D)、ATCC 34874(血清型D)、RV 43185(血清型D)、RV59939(血清型D),和格特隐球菌ATCC 34880(血清型C)、BLS24(血清型B),参照美国国家临床试验标准化委员会CLSI提出的标准,通过微量稀释法研究氨溴索抗隐球菌作用;通过方格棋盘微量稀释法研究氨溴索与氟康唑是否具有协同作用;通过流式细胞术研究氨溴索对隐球菌黏附性的影响;构建体外隐球菌生物膜模型,研究氨溴索对生物膜代谢活性的影响。结果1.核糖体DNA内转录间隔区序列分析及多位点基因序列分析所有临床分离株测序结果经BLAST序列比对示该9株分离株均为隐球菌。多位点序列分析示分离自临床的9株隐球菌临床株中,5株菌为VN Ⅰ型基因型,归入新生隐球菌格鲁比变种;2株菌为VNⅣ型基因型,归入新生隐球菌新生变种;2株菌为VGI型基因型,归入格特隐球菌。2.氨溴索抗隐球菌活性研究氟康唑对所有受试菌株的MIC80值为0.5μg/mL到4μg/mL,氨溴索对所有受试菌株的MIC80值为125μg/mL到500μg/mL。此外,氟康唑联合氨溴索药敏结果显示14株隐球菌菌株的联合抑菌指数为0.50,处在协同作用FICI的临界值;2株联合药敏结果表现为相加作用,未见拮抗作用。基于隐球菌浮游细胞体外药物敏感性实验结果,选择氨溴索亚抑菌浓度。所有隐球菌菌株在氨溴索作用下细胞对微球的黏附百分比下降了 13.13±4.63。结晶紫染色表明所有隐球菌标准株和隐球菌临床株都能形成生物膜。对此,我们使用XTT减低法来测定药物作用下的隐球菌生物膜代谢活性变化。在不同浓度氟康唑孵育下,隐球菌标准株和临床株形成的生物膜均无显著代谢活性变化。与单独使用氟康唑孵育相比,单独使用氨溴索孵育的生物膜表现出色度法改变和代谢活性减低。但是对于成熟生物膜,氨溴索联合氟康唑未见协同效果。结论本研究所用临床分离的隐球菌菌株经鉴定7株为新生隐球菌,2株为格特隐球菌。所有受试菌株的浮游细胞均对氟康唑敏感,体外药敏实验表明氨溴索能抑制隐球菌浮游细胞生长、抑制细胞黏附、降低生物膜代谢活性,与氟康唑联合在抗隐球菌浮游细胞方面不产生拮抗作用。因此氨溴索具有一定的抗隐球菌作用。