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抗体是研究蛋白表达水平与诱导信号相互关系的有力工具,该研究通过构建鼠源天然抗体噬菌体展示文库,用纯化的草鱼IgM从中淘选得到特异识别草鱼IgM的单链抗体,用于草鱼对呼肠孤病毒(GCRV)免疫应答的检测。
鼠源天然抗体噬菌体展示cDNA文库的构建,是从未免疫过的、健康小鼠的骨髓干细胞、外周血淋巴细胞和脾脏细胞中提取和扩增抗体的可变部分基因,与丝状噬菌体M13的P3蛋白基因融合,使抗体以融合蛋白的形式在噬菌体表面展示.由于避免了免疫步骤,收集了骨髓内和骨髓外所有抗体基因,包括自身免疫抗体在内,使该抗体库的多样性大大增加,适用于多种抗原所对应的抗体的选择。本研究构建了高容量的鼠源天然抗体噬菌体展示文库,库容量达到1.2×109。从该抗体库中可以方便地获取针对各种抗原的特异性抗体,避免了针对不同抗原反复构建抗体库的重复工作。
通过技术改进,以硫酸铵盐析法和Protein A柱层析,获得纯化的草鱼IgM。利用SDS-PAGE技术,确定草鱼IgM的重链分子量为75.8kD,轻链分子量为28.2kD,推算其单体分子量应在208kD左右。非还原SDS-PAGE的结果分析显示,草鱼IgM完整的蛋白分子量约800kD,是4个单体的总和,证明了草鱼IgM的四聚体构型。
用纯化的草鱼IgM从鼠源天然抗体噬菌体展示文库中淘选得到特异识别草鱼IgM的单链抗体,对部分单链抗体的基因进行了测序分析。所有阳性克隆的单链抗体只识别草鱼IgM的空间抗原表位,不识别线性抗原表位。
草鱼出血病是草鱼鱼种培育阶段一种广泛流行、危害性较大的病毒性疾病。为研究草鱼对呼肠孤病毒(GCRV)的免疫应答,以硬骨鱼类免疫球蛋白中含量最高的重要免疫应答分子IgM水平为指标,利用单链抗体检测感染呼肠孤病毒的草鱼血清中IgM的诱导表达水平变化。结果显示,攻毒第四天之后,IgM水平上升,6、7天后到达高峰。而感染呼肠孤病毒草鱼血清中特异结合病毒的IgM的实验没有得到预期结果。可能是病毒样品质量不高,浓度过低,或提取后破损很多而导致的。因此本研究的下一步需要改进病毒提取方法,也可用病毒基因表达抗原代替病毒包被ELISA板孔,藉此判断与病毒基因对应的病毒蛋白的抗原性。
本研究的创新点和贡献在于,摸索改进了建库方法,提高了电转化效率,成功构建了高容量鼠源天然抗体噬菌体展示文库；完善了草鱼IgM四聚体结构分析数据；在原来蔗糖梯度和超速离心的基础上,简化了GCRV提取方法；更为草鱼对GCRV的免疫应答反应提供了方便的检测工具和方法,并进行了初步研究,也为寻找有效的重组疫苗提供了可用的抗体工具。