光导波模谱技术及其应用研究

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光导波模谱技术(optical waveguide lightmode spectroscopy,OWLS)是一种利用隐逝场效应,对表面过程进行原位动态研究的非标记光学传感器技术。与表面等离子共振相比,该技术在生物分子传感等领域中的应用没有得到人们足够的重视。本论文基于光导波模谱技术开展了非标记DNA-DNA结合蛋白相互作用、体外配体与受体的作用动力学模型、单引物固相滚环扩增动力学模型、种子介导的纳米颗粒生长过程等一系列应用研究工作,为拓展光导波模谱技术在生物分子传感以及纳米材料生长动力学研究中的应用打下基础。主要内容如下:   1、应用光导波模谱技术研究DNA与DNA结合蛋白的相互作用。本研究通过设计能与NF-κB亚单位p50同源二聚体形成DNA-蛋白质复合物、同时能与固定在传感器芯片表面的DNA探针互补的寡核苷酸,构建了一种新的非标记DNA-DNA结合蛋白相互作用研究体系。利用这一体系成功地对不同样品中NF-κB p50浓度进行了检测,最低检测限达到0.33 nM。研究了三条不同的NF-κB结合序列S1-1、S2-1和S3-1,比较了它们与NF-κB p50亲和力。研究结果与文献报道的电泳迁移率检测得到的实验结果相一致。   2、建立了基于光导波模谱技术的体外血管内皮细胞生长因子(VEGF)与其受体的作用动力学研究模型。通过固定化VEGF,用光导波模谱法对溶液中VEGF受体进行了检测,研究了VEGF受体与VEGF作用的反应动力学,通过对不同浓度的受体分子的在线结合、解离的光导波模谱数据的分析,拟合出相应的结合、解离反应速率常数分别为6.86±0.5×105 M-1 s-1和1.15±0.016×10-3 s-1。   3、利用0WLS的RIM检测模式对单引物固相滚环扩增(rolling circleamplification,RCA)的动态过程进行研究。提出了一种直接由病毒基因组RNA制备滚环扩增反应单链环状模板的方法,成功用于固相RCA。通过对OWLS实验的动力学数据分析,确定了固相RCA反应在开始后的5小时达到平台期。其中,在反应初期dNTP的扩散作用对反应速率起主导作用,反应速率最高达到0.04799 ng.cm-2.s-1。随后,反应速率变化主要和体系中dNTP浓度变化有关,这时该反应是一级反应,其反应速率常数为1.8×10-3s-1。   4、建立了基于OWLS的纳米颗粒动态生长研究平台。利用OWLS的折射率测量模式和波动测量模式,监测了在种子介导的银纳米粒子生长过程中芯片波导层折射率的变化动态。研究表明,随着溶液中种子浓度的升高,银纳米粒子将导致波导层的折射率下降和波导层增厚;在整个实验过程中银纳米粒子的生长是持续的,但生长速率不断下降。相关研究结果得到了原子力显微镜和紫外-可见光谱等实验结果的支持。
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