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背景及目的意义：钩体病是全世界流行的人兽共患传染病,由问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans,简称钩体)感染引起。钩体通过粘膜及皮肤入侵动物体内,通过血液散播至全身各个器官,如肝,肺和肾。在亚洲,欧洲和美洲,钩体病常被报道[2-4]。在钩体感染哺乳动物过程中,不同种类的细胞发挥不同的功能。吞噬细胞能吞噬并降解钩体,保护动物体免受钩体及其他外来病原微生物。钩体在动物体内传播过程中,血管细胞可通过跨膜运输的方式将钩体从血液运送到靶器官(靶器官到血液)的跨膜转运。在转运过程中,钩体的活力无明显变化。本研究的目的是研究不同细胞对钩体的内吞机制的差异性,对今后我们更深入认识钩体在体内的传播途径及运输机制,为我们进一步开发药物,探索新的治疗方法奠定坚实的基础。研究方法：本研究采用THP-1(人单核细胞株)、J774A.1(小鼠单核-巨噬样细胞)、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)为研究材料,研究不同细胞在内吞钩体过程中的机制性差异。ELISA法检测钩体与ECM分子(FN、LN、COL1、COL2、COL3和COL4)的粘附及粘附抑制；激光共聚焦显微镜和ELISA法检测三种细胞的表面ECM分子(FN、LN、COL1、COL2、COL3和COL4)的表达；透射电子显微镜观察三种细胞对钩体的内吞机制；流式细胞法及western-blot检测三种细胞表面ITGB1、 ITGB2、ITGB3和CAV-1的表达；western-blot法检测三种细胞内吞泡表面ITGB1、ITGB2、ITGB3和CAV-1的分布；抗体封闭和siRNA沉默三种细胞ITGB1、ITGB2和ITGB3, filipin阻断三种细胞小窝,siRNA沉默HUVEC的CAV-1,钩体感染各处理细胞,激光共聚焦显微镜检测细胞内钩体荧光强度的变化；三种细胞内吞钩体前后FAK及PI3K磷酸化的变化；FAK及PI3K抑制剂处理三种细胞,钩体感染各处理细胞,激光共聚焦显微镜检测细胞内钩体荧光强度的变化；激光共聚焦显微镜观察钩体感染三种细胞前后,微丝和微管的变化；微丝和微管抑制剂处理三种细胞,钩体感染各处理细胞,激光共聚焦显微镜检测细胞内钩体荧光强度的变化；激光共聚焦3D重建细胞Z轴,观察HUVEC内吞钩体的情况；ITGB1、TGB2、 ITGB3抗体封闭及filipin阻断前后,钩体感染HUVEC, transwell检测细胞双向跨膜转运钩体情况；钩体与CAV-1的共定位；钩体感染三种细胞,钩体与溶酶体及钩体的共定位；钩体被三种细胞内吞,细胞内钩体的生长活力。实验结果：实验结果表明,钩体可以与FN、LN、COL1、COL2、COL3和COL4等ECM分子粘附；激光共聚焦显微镜显示THP-1和J774A.1表面有FN分布,HUVEC表面有FN、LN、COL3和COL4分布,其中每个THP-1细胞表面有4.2×107个FN分子,每个J774A.1细胞表面有3.8x107个FN分布,每个HUVEC表面分别有1.543×107,1.23×106,2.73×106和3.14×106个FN、LN、COL3和COL4分布；透射电子显微镜观察发现三种细胞均能对钩体内吞；流式细胞法及western-blot检测发现THP-1和J774A.1表面有ITGB1、ITGB2和ITGB3分布,HUVEC表面有ITGB1、ITGB3和CAV-1分布；THP-1和J774A.1内吞泡表面有ITGB1分布,]UVEC表面有ITGB1和CAV-1分布；三种细胞被ITGB1抗体封闭和siRNA沉默,钩体感染细胞后,激光共聚焦发现THP-1、J774A.1和HUVEC细胞内吞钩体数量显著降低；HUVEC被filipin阻断(小窝抑制剂)或siRNA沉默CAV-1,钩体感染细胞,激光共聚焦发现细胞内吞钩体数量显著降低；THP-1和J774A.1被钩体感染后,FAK磷酸化显著升高,PI3K磷酸化无显著变化,HUVEC被钩体感染后,PI3K磷酸化显著升高,FAK磷酸化无显著变化；钩体感染被FAK抑制剂处理THP-1、J774A.1,胞内钩体显著降低,钩体感染被PI3K抑制剂处理的HUVEC,胞内钩体显著降低；钩体感染三种细胞后,微丝发生聚集,微管无变化；微丝抑制剂作用三种细胞后,细胞内吞钩体能力显著降低,微管抑制剂作用三种细胞无此作用；激光共聚焦3D重建细胞Z轴显示钩体可以被HUVEC内吞；用Transwell模型研究HUVEC对钩体的跨膜运输,试验结果显示,HUVEC被ITGB1抗体封闭、filipin处理后,细胞跨膜运输钩体的能力显著下降；钩体在三种细胞中的活力存在差异,钩体感染三种细胞,THP-1、J774A.1内钩体与溶酶体共定位,HUVEC内钩体不与溶酶体共定位,导致钩体被THP-1、J774A.1吞噬后,钩体生长活力显著降低于被HUVEC内吞的钩体；钩体感染HUVEC后,钩体与CAV-1共定位。结论：钩体能与细胞表面ECM分子粘附；THP-1、J774A.1和HUVEC均能内吞钩体；THP-1和J774A.1吞噬钩体由ITGBK FAK和微丝介导,HUVEC内吞钩体由ITGB1、CAV-1、PI3K和微丝介导；HUVEC可以对钩体跨膜转运,ITGB1和CAV-1介导了这一过程；HUVEC内钩体与CAV-1共定位,显示钩体在HUVEC中的跨膜转运很可能是通过小窝介导的；钩体被THP-1及J774A.1吞噬后与溶酶体结合,钩体活力下降,HUVEC内钩体不与溶酶体融合,钩体活力无显著变化。综上,在细胞内吞钩体过程中,吞噬细胞和血管内皮细胞内吞钩体的机制存在差异,吞噬细胞主要执行吞噬降解钩体功能,血管内皮细胞主要执行对钩体的跨膜运输作用。