【摘 要】
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表皮毛是植物表皮细胞一种特化的表皮附属物,对植物抗逆境胁迫、植物病虫害防御等起重要作用。在模式植物拟南芥中,表皮毛形成的分子机制已被初步阐释,但仍有一些未知的调控因子尚未被发现。前期研究发现,转Ch IFN-γ烟草的腺毛密度增加了1倍以上。通过Agilent-基因芯片检测转Ch IFN-γ烟草全基因表达谱,筛选出7个与腺毛发育相关基因,利用荧光定量PCR验证,最终获得Cy P71、LBM1、Isp
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表皮毛是植物表皮细胞一种特化的表皮附属物,对植物抗逆境胁迫、植物病虫害防御等起重要作用。在模式植物拟南芥中,表皮毛形成的分子机制已被初步阐释,但仍有一些未知的调控因子尚未被发现。前期研究发现,转Ch IFN-γ烟草的腺毛密度增加了1倍以上。通过Agilent-基因芯片检测转Ch IFN-γ烟草全基因表达谱,筛选出7个与腺毛发育相关基因,利用荧光定量PCR验证,最终获得Cy P71、LBM1、Isp H和CAF1 4个候选基因,并将Cy P71、LBM1和Isp H遗传转化拟南芥后观察植物表皮毛变化,发现过表达植株表皮毛明显增多。因此,本研究选择候选基因CAF1（CCR4-assocaited factor 1）作为目的基因,通过遗传转化拟南芥,研究其对拟南芥表皮毛生长发育的调控作用。主要研究内容及结果如下:1.通过生物信息学在线分析软件SWISS-MODEL比较拟南芥At CAF1a（AT3G44260）和野生型烟草Nt CAF1（KJ003855）的蛋白质三维结构,其结果表明,烟草Nt CAF1和拟南芥At CAF1a的蛋白质结构域相似,均具有1个高度保守结构域CAF1 super family,该结构域负责催化m RNA腺苷酸化,且CCR4-CAF1复合物在真核生物中高度保守;2.构建Nt CAF1目的基因的过表达载体p SH737-Nt CAF1并转化农杆菌LBA4404,通过蘸花法遗传转化拟南芥,GUS染色结果表明:GUS报告基因在转Nt CAF1拟南芥的营养器官（根、茎和叶）中均能启动表达。转Nt CAF1植株较同时期的野生型相比,其长势稍好,叶片较大;说明Nt CAF1具有促进拟南芥营养器官发育的功能。3.通过观察表皮毛发现,Nt CAF1拟南芥表皮毛数量较WT增多。统计分析发现,与WT拟南芥的幼苗期、抽薹期和结荚期相比,转Nt CAF1拟南芥表皮毛数量均显著增加,分别为WT的1.4倍、2.42倍和1.58倍,而?caf1a拟南芥突变体植株的表皮毛均显著减少,分别为WT的0.68倍、0.71倍和0.82倍。表明CAF1的表达与拟南芥表皮毛的发育呈正相关。4.利用荧光定量PCR检测Nt CAF1转基因株系、WT和?caf1a拟南芥突变体植株中调控表皮毛发育的关键基因（GL1、GL2、TTG1、EGL3、CPC）表达量。结果显示:与WT的不同时期相比,转Nt CAF1植株中GL1、GL2、TTG1和EGL3的表达均显著增加,CPC的表达量降低;在?caf1a突变体植株中GL1、GL2、TTG1和EGL3的表达量降低,CPC的表达量升高。同时在转Nt CAF1拟南芥植株叶片中CAF1表达量显著高于WT;说明提高CAF1的转录活性,可以间接的影响MBW三蛋白复合体（GL1、EGL3和TTG1）的表达。5.有研究报道将番茄中的CAF1过表达到辣椒中,发现辣椒中调控JA合成的关键基因AOC和AOS表达上升。因此本研究为了进一步揭示在转Nt CAF1植株中调控毛状体发育的关键基因表达上调的原因,检测不同时期的转Nt CAF1、WT和?caf1a突变体拟南芥中JA合成关键基因,即AOS和AOC的表达量。发现在转Nt CAF1植株叶片中,JA合成关键基因AOC和AOS的表达显著增加,而在?caf1a突变体植株中AOC和AOS的表达量显著降低。进一步通过LC-MS检测转Nt CAF1植株、WT和?caf1a拟南芥植株叶片内源茉莉酸和水杨酸的含量。结果显示,转Nt CAF1拟南芥植株抽薹期叶片中的JA和SA含量显著高于WT 1.15倍和1.52倍,而?caf1a突变体拟南芥植株抽薹期叶片的JA和SA含量显著低于WT 0.74倍和0.82倍;在结荚期,转Nt CAF1拟南芥植株叶片中Me SA、JA和Me JA的含量显著高于WT,分别为野生型的1.78倍、1.14倍和1.83倍,而?caf1a拟南芥突变体植株叶片中Me SA、JA和Me JA的含量显著低于WT,分别为野生型的0.73倍、0.66倍和0.87倍;然而在转Nt CAF1和?caf1a突变体拟南芥植株叶片中SA的含量与野生型相比无显著差异。表明:改变CAF1的转录水平会直接或间接的影响拟南芥内源激素（JA、Me JA、SA、Me SA）的含量变化。研究通过LC-MS检测拟南芥植株内源激素的含量发现,在过表达CAF1的拟南芥植株中JA含量显著增加,而在?caf1a突变体拟南芥植株中JA的含量显著降低,表明CAF1存在于JA的上游。因此,CAF1通过未知途径影响了JA的含量变化,JA含量的积累,使得MYB-b HLH-WD40复合物的转录得以增强,促进了GL2的表达,从而调控了拟南芥表皮毛的发育。
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