东海海参多糖的分离纯化、结构解析及其抗凝血活性研究

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海参为棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothurioider)动物的总称,东海海参(Acaudina molpadioidea)属芋参目(Molpadida)尻参科(Caudinidae),是光参的一种,俗称香参,也称白参、茄参、海茄子,它广泛分布在浙江沿海一带且产量十分丰富。现有糖生物学研究表明,在刺参中提取的氨基半乳糖、葡萄糖醛酸和岩藻糖等具有增强免疫力、抑制肿瘤、抗凝血、促进纤维蛋白溶解、降低血黏度、保护神经组织等多种功效。本文从东海海参体壁中提取分离多糖,并对纯化所得的单一多糖组分的结构和活性进行了研究,为东海海参的利用与开发提供参考。   由于海参生活在海洋中,表皮结合有一层金属与泥沙的混合物,其主要物质为Fe2+和Ca2+,因此在简单的清洗后,采用丙酮浸泡法去除,然后利用不同蛋白酶酶解提取东海海参多糖。通过单因素试验和响应面分析法对东海海参多糖的提取条件进行了优化,得到的最佳提取工艺如下:以胃蛋白酶进行酶促反应,酶解时间5.42h,酶解温度56.19℃,酶解液pH1.12,胃蛋白酶用量0.95%。经苯酚-硫酸法测定最佳提取条件下的多糖得率为1.59%,该条件下所得的多糖提取液冷冻干燥后得多糖粗品命名为AMP。   本文采用三氯乙酸法对粗多糖进行除蛋白处理,进一步研究了透析、DEAE Sepharose FF离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶柱层析等纯化方法对AMP进行了进一步分离纯化,分级后得到两个组分,分别命名为AMP-1和AMP-2。并通过凝胶渗透色谱法和醋酸薄膜电泳法纯度分析确定AMP-1和AMP-2均为单一组分。   采用化学方法研究了AMP-2的一级化学结构。通过红外光谱确定AMP-2中存在的特征官能团,初步判断AMP-2为糖类化合物。采用高效凝胶色谱法测定了AMP-2的分子量,即为2.4×104Da。采用气相色谱法分析了AMP-2的单糖组分。结果表明,AMP-2是主要由4种单糖组成的杂多糖,其组成为硫酸岩藻糖、葡萄糖、半乳糖,氨基半乳糖,其摩尔比为1:3:0.5:2,还有少部分的果糖和甘露糖。   甲基化分析表明AMP-2的糖亚基中主要存在以下几种连接方式的单糖残基:1-substituted- Galp,1,4-disubstituted- GalNp,1,2-disubstituted- FucSp,1,4,6-trisubstituted- Glcp其摩尔比大约为0.5:2:1:3。   经过对AMP-2的结构进行初步分析后,选择对AMP-2进行硫酸酯化反应和羧甲基化反应,分别得到AMP-3和AMP-4,其取代度分别为2.37和0.96。通过体外抗凝血实验对海参多糖各组分进行了抗凝血活性筛选,最后证实硫酸酯化后的海参多糖AMP-3活性最高。
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