邻苯二甲酸丁基苄酯对昆明小鼠和N2a神经瘤细胞的神经毒性

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邻苯二甲酸丁基苄酯(Butylbenzylphthalate,BBP)是邻苯二甲酸酯类化合物PAEs的一种,具有很强的软化和溶剂化能力,可作增塑剂用;因此,在全球范围内得到大量的生产和广泛的运用。与此同时,作为七十种环境激素之一,它也已成为全球性的有机污染物,引起了国内外专家学着的高度重视和广泛关注。已有研究发现它具有生殖毒性、发育毒性、氧化损伤作用及内分泌干扰作用。但其对人和动物的神经毒性的研究目前尚少,而且其作用机制也尚不清楚。本研究采用小鼠行为学的方法、细胞活力测定、酶活测定、显微荧光技术,以整体动物毒理实验和细胞毒性实验相结合,综合评价BBP的神经毒性;通过对ROS水平和氧化损伤作用检测以及致凋亡作用的研究,初步探讨BBP对神经细胞损伤的作用机理。   采用浓度为0(空白对照组),50,250和1,250mg/kg的BBP对昆明小鼠进行灌胃染毒(14d),同时进行Morris水迷宫实验、悬尾实验以及强迫游泳实验,检测BBP对小鼠学习和记忆能力的影响;在染毒结束后取脑、肝、肾组织进行氧化损伤水平的测定。此外,取各组脑组织大脑海马区做组织切片进行显微观察。   结果显示,在水迷宫实验中0mg/kg和50mg/kgBBP染毒组小鼠均在平台所在象限的游泳时间较长,在非平台所在象限游泳时间相比平台象限短了很多。0mg/kg染毒组小鼠在平台象限(SE象限)的游泳时间与其他象限的游泳时间有显著性的差异。而1,250mg/kg染毒组小鼠在SE象限游泳的时间较短,相对与0mg/kg染毒组小鼠在SE象限的游泳时间有显著性的差异(P<0.05)。而在悬尾实验中,50和1,250mg/kg染毒组小鼠相对于空白对照组的悬尾不动时间延长(P<0.05),在1,250mg/kg的高剂量浓度时小鼠的悬尾不动时间相对于空白对照组出现极显著差异,(P<0.01)。与悬尾实验结果不同的是;强迫游泳实验中,在设定的浓度范围能未出现极显著性的差异;仅在1,250mg/kg染毒组时小鼠的不动时间对比与空白对照组才出现显著性差异(P<0.05)。   在氧化损伤水平检测中,ROS产生水平在脑、肝、肾各组织中各不相同;250mg/kg染毒组小鼠肝肾中ROS水平与对照组相比显著性升高(P<0.05),而在1,250mg/kg染毒组小鼠相较于对照组,脑中ROS水平出现显著性升高(P<0.05),肝和肾中ROS水平有极显著性的升高(P<0.01)。1,250mg/kgBBP染毒组小鼠脑肝肾各组织中MDA的含量与对照组相比有显著性升高(P<0.01)。在GSH含量的测定中,脑组织在250mg/kgBBP染毒组与对照组相比,具有显著性差异(P<0.05),而肝和肾在1,250mg/kgBBP染毒组相比对照组,才出现显著性差异(P<0.05)。   大脑海马区组织切片表明,随着BBP染毒浓度的增加,小鼠大脑海马区细胞不完整性增强,1,250mg/kgBBP染毒组小鼠大脑海马区细胞出现凋亡现象。控制小鼠空间学习记忆的背侧1/3的海马细胞受到损伤,因此推测高浓度BBP导致CA1区迟发性神经元死亡引起空间学习记忆障碍。   采用浓度为10g/L、5g/L、2.5g/L、1.25mg/L、0.625g/L、0.3125g/L、0.156g/L、0.078g/LBBP染毒小鼠神经瘤细胞(N2a)。通过MTT来检测BBP对细胞的毒性;同时,测定细胞中ROS的产生水平以及显微观察ROS产生的程度;进而测定细胞中MDA和GSH含量,反映BBP对细胞的氧化损伤程度。通过hoechst33258染色观察细胞的凋亡程度。   结果显示,在10g/LBBP染毒24h后ROS水平相对与对照组出现显著性;染色后荧光显微观察,随着染毒浓度的升高,荧光强度也越来越大。MTT测定实验显示,在10g/L、5g/L对比空白对照组均出现了显著性的差异,其他浓度组MTT有一定的升高,表现出了低浓度BBP对细胞生长有一定的促进作用。Hoechst33258染色结果显示,随着染毒浓度增加细胞核不规则程度增加,出现凋亡小体等;并且在常规镜下观察时,细胞界限不清。本研究表明高浓度的BBP具有神经细胞毒性。
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