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研究背景与目的：
前列腺癌作为男性发病率最高的癌症已成为美国和欧洲男性癌症相关的第二死因，泛素连接酶SPOP突变是前列腺癌病人中发生率最高的突变，出现在10%左右的前腺癌病人中，而SPOP突变的位点与其泛素连接酶的作用密切相关，许多重要的癌蛋白如BRD4、SRC3、TRIM24等已被发现为SPOP的降解底物，挖掘SPOP新底物和理解其关键底物功能对前列腺癌的精准治疗具有重要意义。具有复杂多样结构域的TRIM24作为SPOP最早发现的底物之一，其既是泛素连接酶，也是转录激活因子，可通过多种分子生物学途径调控癌症的发生发展，自噬可通过提供必须的营养物质以及调节细胞稳态进而促进癌细胞的存活，另外，自噬作用还可引起一些癌症治疗抵抗，最近研究表明TRIM家族可调控自噬的发生发展，而SPOP、TRIM24与自噬之间的关系目前还没有研究报道，本研究旨在探讨SPOP与自噬之间的关系，研究SPOP对自噬关键蛋白的调控作用，并从分子水平深入探讨这种调控作用的详细机制及对细胞生物学功能的影响。
方法：
我们构建了SPOPWT与SPOPKO前列腺癌C42细胞系，无氨基酸培养基饥饿处理，通过不同方法检测组间自噬水平的变化，包括电镜检测组间自噬泡的数量、双荧光LC3质粒检测自噬流的变化、Westernblot检测自噬相关基因的表达情况，检测SPOPWT与SPOPKO的MEFs细胞及SPOP敲低、Cullin3敲低前列腺癌细胞中ULK1表达差异，利用蛋白酶体抑制剂MG132和Cullin家族抑制剂MLN4924处理前列癌细胞，观察蛋白酶体途径对ULK1表达的影响，在细胞中外源过表达转染SPOP及其突变体，检测对ULK1表达的影响，放线菌酮处理SPOPWT与SPOPKO前列腺癌C42细胞，检测ULK1的稳定性变化，免疫共沉淀检测SPOP及其突变与ULK1的相互作用，寻找ULK1蛋白序列中的SPOP降解序列，构建序列缺失突变体，免疫共沉淀检测SPOP与及结合情况，外源共转染SPOP及ULK1突变体，检测其表达变化，泛素化修饰试验检测外源转染SPOP对ULK1的泛素化修饰的影响，免疫共沉淀检测ULK1与TRIM24的结合情况，通过过表达和敲低TRIM24，检测ULK1的蛋白及mRNA表达变化，泛素化修饰试验检测外源转染TRIM24对ULK1的泛素化修饰的影响，构建TRIM24和ULK1的结构域缺失突变体，免疫共沉淀检测两者结合情况的变化，及其表达量的影响，克隆形成实验和细胞增殖实验检测TRIM24和ULK1对前列腺癌细胞增殖生长的影响，细胞增殖实验检测ULK1激酶抑制剂ULK-101对前列腺癌细胞增殖的影响。
结果：
1.SPOPKO前列腺癌细胞系C42中在无氨基酸培养基饥饿诱导的条件下自噬泡数量明显增多，LC3双荧光载体转染饥饿实验发现SPOPKO前列腺癌细胞系C42中红光增多且自噬斑点数目增加，另外，饥饿状态下SPOPKO前列腺癌细胞系C42中LC3BII表达升高，表明SPOPKO可明显促进自噬的发生，说明SPOP功能缺失型前列腺癌可能通过自噬途径促进前列腺癌细胞的存活及恶性程度。
2.SPOPKO前列腺癌细胞系C42中ULK1蛋白表达升高，ULK1蛋白半衰期延长而mRNA水平表达没有明显差异，此外MEFsSPOPKO细胞系中和前列腺癌细胞系RV1shSPOP组ULK1表达升高，而外源转染SPOP后ULK1表达降低，表明SPOP与ULK1存在负调控。
3.MG132和MLN4924处理前列腺癌细胞系，ULK1表达升高，且敲低Cullin3可促进ULK1的蛋白表达升高。
4.ULK1可与SPOP相互作用，且SPOP-F102C及SPOP-W131G突变可影响ULK1与SPOP的相互作用并稳定ULK1的蛋白表达。
5.泛素化修饰实验发现梯度转染SPOP可降低ULK1的泛素化修饰，删除ULK1蛋白中的SPOP降解序列并不能影响其与SPOP的相互作用且不能抵抗SPOP对ULK1的负调控作用，说明ULK1并不是SPOP的底物，SPOP负调控ULK1可能通过其他蛋白调控机制来实现的。
6.内源和外源免疫共沉淀实验发现ULK1可结合TRIM24，并在SPOPKO细胞系中结合增强，
7.前列腺癌细胞系中过表达TRIM24可促进ULK1的表达，敲低TRIM24可降低ULK1表达，说明TRIM24与ULK1存在正调控，
8.LC3双荧光载体转染饥饿实验发现TRIM24可促进自噬的发生，泛素化修饰实验表明梯度表达的TRIM24增加ULK1的泛素化水平，
9.免疫共沉淀实验发现TRIM24与ULK1的结合依赖于其B1-B2-BBC结构域，而ULK1的Kniase结构域不与TRIM24结合，
10.克隆形成实验和CCK8细胞增殖实验均发现敲低TRIM24和ULK1可有效抑制前列腺癌细胞的生长增殖，
11.无氨基酸培养基饥饿条件下ULK1激酶抑制剂ULK1-101可抑制前列腺癌细胞的增殖，而ULK1的蛋白丰度在很大程度上决定了SPOP缺陷的前列腺癌细胞对ULK1激酶抑制剂ULK1-101的敏感性。
结论：
在前列腺癌中，SPOP可以促进自噬的发生，可能通过负调控ULK1来实现的，但进一步实验发现ULK1并不是SPOP的底物。而ULK1与TRIM24在SPOP缺失型前列腺癌细胞中结合增加，进一步发现TRIM24对ULK1存在正调控，并可促进ULK1泛素化水平的增加，表明TRIM24可通过泛素化途径稳定了ULK1的表达，最后通过ULK1小分子抑制剂ULK1-101处理发现在营养缺乏下抑制ULK1介导的自噬可抑制前列腺癌的增殖，SPOP缺失型前列腺癌可能通过增强ULK1的表达来对抗饥饿环境，从而获得更强的生存能力。
前列腺癌作为男性发病率最高的癌症已成为美国和欧洲男性癌症相关的第二死因，泛素连接酶SPOP突变是前列腺癌病人中发生率最高的突变，出现在10%左右的前腺癌病人中，而SPOP突变的位点与其泛素连接酶的作用密切相关，许多重要的癌蛋白如BRD4、SRC3、TRIM24等已被发现为SPOP的降解底物，挖掘SPOP新底物和理解其关键底物功能对前列腺癌的精准治疗具有重要意义。具有复杂多样结构域的TRIM24作为SPOP最早发现的底物之一，其既是泛素连接酶，也是转录激活因子，可通过多种分子生物学途径调控癌症的发生发展，自噬可通过提供必须的营养物质以及调节细胞稳态进而促进癌细胞的存活，另外，自噬作用还可引起一些癌症治疗抵抗，最近研究表明TRIM家族可调控自噬的发生发展，而SPOP、TRIM24与自噬之间的关系目前还没有研究报道，本研究旨在探讨SPOP与自噬之间的关系，研究SPOP对自噬关键蛋白的调控作用，并从分子水平深入探讨这种调控作用的详细机制及对细胞生物学功能的影响。
方法：
我们构建了SPOPWT与SPOPKO前列腺癌C42细胞系，无氨基酸培养基饥饿处理，通过不同方法检测组间自噬水平的变化，包括电镜检测组间自噬泡的数量、双荧光LC3质粒检测自噬流的变化、Westernblot检测自噬相关基因的表达情况，检测SPOPWT与SPOPKO的MEFs细胞及SPOP敲低、Cullin3敲低前列腺癌细胞中ULK1表达差异，利用蛋白酶体抑制剂MG132和Cullin家族抑制剂MLN4924处理前列癌细胞，观察蛋白酶体途径对ULK1表达的影响，在细胞中外源过表达转染SPOP及其突变体，检测对ULK1表达的影响，放线菌酮处理SPOPWT与SPOPKO前列腺癌C42细胞，检测ULK1的稳定性变化，免疫共沉淀检测SPOP及其突变与ULK1的相互作用，寻找ULK1蛋白序列中的SPOP降解序列，构建序列缺失突变体，免疫共沉淀检测SPOP与及结合情况，外源共转染SPOP及ULK1突变体，检测其表达变化，泛素化修饰试验检测外源转染SPOP对ULK1的泛素化修饰的影响，免疫共沉淀检测ULK1与TRIM24的结合情况，通过过表达和敲低TRIM24，检测ULK1的蛋白及mRNA表达变化，泛素化修饰试验检测外源转染TRIM24对ULK1的泛素化修饰的影响，构建TRIM24和ULK1的结构域缺失突变体，免疫共沉淀检测两者结合情况的变化，及其表达量的影响，克隆形成实验和细胞增殖实验检测TRIM24和ULK1对前列腺癌细胞增殖生长的影响，细胞增殖实验检测ULK1激酶抑制剂ULK-101对前列腺癌细胞增殖的影响。
结果：
1.SPOPKO前列腺癌细胞系C42中在无氨基酸培养基饥饿诱导的条件下自噬泡数量明显增多，LC3双荧光载体转染饥饿实验发现SPOPKO前列腺癌细胞系C42中红光增多且自噬斑点数目增加，另外，饥饿状态下SPOPKO前列腺癌细胞系C42中LC3BII表达升高，表明SPOPKO可明显促进自噬的发生，说明SPOP功能缺失型前列腺癌可能通过自噬途径促进前列腺癌细胞的存活及恶性程度。
2.SPOPKO前列腺癌细胞系C42中ULK1蛋白表达升高，ULK1蛋白半衰期延长而mRNA水平表达没有明显差异，此外MEFsSPOPKO细胞系中和前列腺癌细胞系RV1shSPOP组ULK1表达升高，而外源转染SPOP后ULK1表达降低，表明SPOP与ULK1存在负调控。
3.MG132和MLN4924处理前列腺癌细胞系，ULK1表达升高，且敲低Cullin3可促进ULK1的蛋白表达升高。
4.ULK1可与SPOP相互作用，且SPOP-F102C及SPOP-W131G突变可影响ULK1与SPOP的相互作用并稳定ULK1的蛋白表达。
5.泛素化修饰实验发现梯度转染SPOP可降低ULK1的泛素化修饰，删除ULK1蛋白中的SPOP降解序列并不能影响其与SPOP的相互作用且不能抵抗SPOP对ULK1的负调控作用，说明ULK1并不是SPOP的底物，SPOP负调控ULK1可能通过其他蛋白调控机制来实现的。
6.内源和外源免疫共沉淀实验发现ULK1可结合TRIM24，并在SPOPKO细胞系中结合增强，
7.前列腺癌细胞系中过表达TRIM24可促进ULK1的表达，敲低TRIM24可降低ULK1表达，说明TRIM24与ULK1存在正调控，
8.LC3双荧光载体转染饥饿实验发现TRIM24可促进自噬的发生，泛素化修饰实验表明梯度表达的TRIM24增加ULK1的泛素化水平，
9.免疫共沉淀实验发现TRIM24与ULK1的结合依赖于其B1-B2-BBC结构域，而ULK1的Kniase结构域不与TRIM24结合，
10.克隆形成实验和CCK8细胞增殖实验均发现敲低TRIM24和ULK1可有效抑制前列腺癌细胞的生长增殖，
11.无氨基酸培养基饥饿条件下ULK1激酶抑制剂ULK1-101可抑制前列腺癌细胞的增殖，而ULK1的蛋白丰度在很大程度上决定了SPOP缺陷的前列腺癌细胞对ULK1激酶抑制剂ULK1-101的敏感性。
结论：
在前列腺癌中，SPOP可以促进自噬的发生，可能通过负调控ULK1来实现的，但进一步实验发现ULK1并不是SPOP的底物。而ULK1与TRIM24在SPOP缺失型前列腺癌细胞中结合增加，进一步发现TRIM24对ULK1存在正调控，并可促进ULK1泛素化水平的增加，表明TRIM24可通过泛素化途径稳定了ULK1的表达，最后通过ULK1小分子抑制剂ULK1-101处理发现在营养缺乏下抑制ULK1介导的自噬可抑制前列腺癌的增殖，SPOP缺失型前列腺癌可能通过增强ULK1的表达来对抗饥饿环境，从而获得更强的生存能力。