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核酸扩增是一项基本的生物技术，在医疗、农业、环境监测和取证等各个方面有着不可替代的作用。传统的核酸扩增使用聚合酶链式反应，即PCR技术。作为一种经典的扩增检测方法，同以其为基础发展而来的实时荧光定量PCR（qPCR）技术，被广泛的应用于核酸的扩增与检测领域。但这一技术在食品领域应用时会出现易受污染产生假阳性，有聚合酶抑制剂时使用困难，背景核酸大量存在时灵敏度大幅降低等问题。这些缺点限制了PCR直接用于检测食品中外源微生物。同时，作为一种变温扩增技术，PCR特异性的发挥需要精确的控温仪器，不符合基层现场快速检测的要求。因此需要开发一种新的核酸扩增技术，能够摆脱对精确控温仪器的依赖，同时能够从食品中检测出外源病毒和细菌，即能够在大量背景核酸存在的条件下特异性检测目标序列的存在，以达到在食品领域真正广泛应用的目标。滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA），是一种在等温条件下就能特异性扩增目标片段的扩增技术，主要利用环状模板和具有链置换能力的DNA聚合酶环绕模板进行周期性的复制。常见技术应用为都以锁式探针RCA（padlock-RCA）引发扩增。虽然灵敏度高，但也有单链探针不稳定、探针与模板容易错配、扩增产物并非目标序列而是互补的探针自身的缺点。针对于此，本文使用了一种全新的目标成环RCA（Target-circularization RCA，TC-RCA）：利用限制性内切酶酶切样品，产生具有9nt粘性末端的序列；其次，设计与目标序列粘性末端完全互补配对的双链接头，在连接酶的作用下同目标序列连接成环；利用具有链置换活性的DNA聚合酶，在两条引物的作用下引发超分支-RCA（Hyper-branched RCA）；最后，扩增产物再经过限制性内切酶酶切，得到扩增后的目的片段。在此基础上，利用高特异性的DNA连接酶、生物素修饰接头、链霉亲和素磁珠以及磁性分离等手段，构建了磁珠辅助的TC-RCA技术。该项技术能够在等温条件下从大量背景核酸中检测出目标序列，从根本上解决了检测特异性和灵敏度之间的矛盾关系，特别适用于检测食品中有害微生物的存在。论文主要从以下几个方面研究建立特异性核酸检测方法。（1）TC-RCA的可行性，证明了TC-RCA具有在无背景核酸条件下扩增目标DNA片段的能力，敏感度为6×104个拷贝分子。同时，接头能稳定结合于固相磁珠表面，并且设计的接头固定于固相表面后不影响连接与扩增，为TC-RCA在芯片上实现目标成环等温扩增提供了技术支持和理论依据。（2）TC-RCA可以在大量背景核酸中检测出目标序列，敏感度达到6×106个拷贝分子，但结果伴有非特异性扩增。使用连接忠实度较高的Taq DNA连接酶进行连接，没有能够达到提高特异性的目的。主要是由于Taq DNA连接酶在非正常的缓冲液条件下，区别错配能力降低所致。说明TC-RCA已经初步具备成为一种新型检测方法的能力，同时为后续的实验提供了解决问题的思路和依据。（3）通过磁珠辅助将扩增子与背景DNA和Taq DNA连接酶分离，同时结合其它条件的优化探索，使得磁珠辅助的TC-RCA可以在高背景核酸存在的条件下特异性地扩增目的片段，敏感度为60个拷贝分子，并且没有任何非特异性扩增出现。经过对各个步骤的精简优化，检测结果24h之内即可获得。磁珠辅助的TC-RCA通用性强，更适用于基层和现场快速检测。（4）磁珠辅助TC-RCA适用于检测水产品中有害细菌，SYBR Green I染色结果表明该技术可以特异地检测出水产品中的外源细菌，最低检测限达到100个细菌基因序列拷贝分子。同其它检测水产品中有害微生物的方法相比，本方法不需要进行增菌实验，检测的结果可以直接反应食品被细菌污染的最初状态。同时反应不依赖精密控温仪器，常用水浴锅就满足检测要求，为基层现场快速检测食品中细菌提供了一种强有力的技术手段。