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背景磷脂转运蛋白(phospholipid transfer protein, PLTP)在脂代谢中的作用已受到关注。PLTP可以转运磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇和鞘磷脂,并能够锚定到这些磷脂。而在血浆中,PLTP主要锚定于高密度脂蛋白。除了转运磷脂,PLTP还参与维生素E在脂蛋白和细胞膜之间的转运。在PLTP活性降低时,可使得含apoB的脂蛋白中维生素E含量增加。PLTP也参与脂多糖的转运,增强机体对炎症的反应。PLTP可以把磷脂和游离的胆固醇从富含甘油三酯的脂蛋白转运到高密度脂蛋白颗粒中。另外,PLTP还可以促进前β-HDL的形成,进而促进胆固醇的转移。PLTP除了这些潜在的抗动脉粥样硬化作用外,还有很多研究发现其具有潜在的致动脉粥样硬化的作用。PLTP基因敲除后,动脉壁的炎症因子明显减少,动脉粥样硬化的发生也降低。PLTP转基因鼠的巨噬细胞胆固醇流出和体内胆固醇逆向转运受损。动脉粥样硬化是一个由诸多因素引起的复杂病理过程。它的特点是受累的动脉由内膜开始,各种病变交替存在。动脉粥样硬化以巨噬细胞的浸润、平滑肌细胞迁移增殖、内皮细胞功能异常和细胞内外脂质的不断累积为特点。既往关于PLTP的研究,主要集中在血浆脂质代谢以及巨噬细胞脂质代谢等相关领域。PLTP对动脉粥样硬化的影响是否只局限于这些还是个未知数。动脉粥样硬化病理过程中的脂质、胶原、巨噬细胞和平滑肌细胞量的变化是否有PLTP的参与依然尚未明了。为了验证PLTP在动物体内对动脉粥样硬化斑块的影响,我们构建重组的PLTP腺病毒,然后采取不同的途径和剂量转染Apo-/-E小鼠,观察PLTP对动脉粥样硬化斑块内组成成分是否有影响。目的1.探讨不同方式PLTP过表达对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的影响；2.探讨PLTP对动脉粥样硬化斑块的影响是否具有剂量依赖性。方法1. Ad-PLTP腺病毒的构建首先构建pEASY-T1-PLTP载体,随后构建pDC316-mCMV-EGFP-PLTP重组穿梭质粒,最后将穿梭质粒包装成腺病毒并测定其病毒滴度。2.动物实验流程将8周龄的雄性ApoE-/-小鼠高脂喂养2周后,行右侧颈动脉套管术。套管8周后,根据干预措施不同,分为5个亚组(12只/组)：生理盐水组；空病毒组；局部PLTP组；尾静脉低PLTP组；尾静脉高PLTP组。病毒干预2周后,麻醉处死小鼠并收集标本。3.血脂和体重的测定实验结束,立即采取小鼠腹腔静脉血,留取血清分装后冻存于-80℃冰箱备用。采用酶法检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度。4.病理学检查大体油红O染色监测主动脉斑块生长情况；颈动脉冰冻切片做HE染色、天狼猩红染色、油红O染色；并通过免疫组化染色检查颈动脉的SMC、MOMA-2及P4Ha1蛋白的表达情况。5.实时定量PCR检测斑块内MCP-1、ICAM-1和MMP-9mRNA的表达水平。6.计量资料两组之间比较采用独立样本t检验；多组样本之间比较时,采用方差分析(ANOVA)。各组数据用SPSS16.0软件进行统计。以P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.各组ApoE-/-小鼠血脂及体重指标的变化空病毒组与生理盐水组相比较,血脂各项指标均无显著差异(P>0.05)。与生理盐水组或空病毒组比较,局部PLTP组和尾静脉高PLTP组血清中HDL-C的含量显著升高(P<0.05)。各组小鼠体重未见显著的统计学差异(P>0.05)。2. ApoE-/-小鼠病毒转染效率的检测在转染ApoE-/-小鼠PLTP腺病毒的7天后取材,检测转染病毒的小鼠颈动脉斑块中GFP蛋白的表达。转染病毒后,与对照组比较,GFP表达明显升高,转染率可达到70%。3.各组ApoE-/-小鼠斑块生长及斑块负荷的差异各组ApoE-/-小鼠颈动脉在体拍照显示,局部和尾静脉高PLTP腺病毒转染组,颈动脉斑块的生长明显增加。大体油红O染色结果显示,空病毒与生理盐水组相比较,斑块负荷未见明显差异(P>0.05)；与生理盐水组和空病毒组相比较,局部PLTP组和尾静脉高PLTP组小鼠斑块负荷均明显升高(P<0.05)；尾静脉高PLTP组与尾静脉低PLTP组相比较,斑块负荷明显升高(P<0.05),提示PLTP对斑块负荷的影响有剂量依赖性。HE染色：生理盐水组和空病毒组相比较,斑块面积没有明显变化；与生理盐水组和空病毒组相比较,转染PLTP腺病毒的局部PLTP组和尾静脉高PLTP组小鼠的斑块面积显著增加(P<0.05)；与尾静脉低PLTP组相比较,尾静脉高PLTP组斑块面积明显增加(P<0.05)。4.各组ApoE-/-小鼠斑块成分的病理学分析各个干预组ApoE-/-小鼠的脂质含量未见显著性差异(P>0.05)；与生理盐水组和空病毒组相比较,局部PLTP组、尾静脉低PLTP组和尾静脉高PLTP组小鼠颈动脉斑块中胶原和平滑肌细胞的含量明显减少(P<0.05),巨噬细胞的含量显著增加(P<0.05)；与尾静脉低PLTP组相比,尾静脉高PLTP组斑块中胶原含量和平滑肌细胞明显减少,巨噬细胞含量明显增加(P<0.05)。这些改变提示,不同剂量的PLTP对斑块内成分影响不同,并且这种影响有剂量依赖的趋势。5.各组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块中P4Hα1蛋白的检测与生理盐水组和空病毒组相比较,局部PLTP组、尾静脉低PLTP组和尾静脉高PLTP组小鼠颈动脉斑块中P4Hα1的含量明显减少(P<0.05)；与尾静脉低PLTP组相比较,尾静脉高PLTP组P4Hα1的含量显著减少(P<0.05)。6.各组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块中炎症相关基因mRNA水平的差异与生理盐水组和空病毒组相比较,局部PLTP组、尾静脉低PLTP组和尾静脉高PLTP组小鼠颈动脉斑块中MCP-1、ICAM-1和MMP-9mRNA水平显著升高(P<0.05)。与尾静脉低PLTP组相比较,尾静脉高PLTP组MCP-1、ICAM-1和MMP-9mRNA水平明显升高(P<0.05)。结论1.PLTP过表达可促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的发展,同时增加斑块内的炎症反应；2. PLTP对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的影响具有剂量依赖性,而不同干预方式无显著性区别。背景动脉粥样硬化的机制非常复杂,至今仍然未完全明了。脂源性学说和炎症学说是目前比较公认的学说。而动脉粥样硬化发生的各种机制,最终归结到由组成动脉粥样硬化斑块中成分如内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞发生病理改变引起。内皮细胞功能失调、分泌大量的炎症因子和粘附分子,平滑肌细胞向内膜下迁移能力增强,巨噬细胞泡沫化程度加重、凋亡增加,这些都可以导致动脉壁发生动脉粥样硬化。活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)是动脉粥样硬化中血管炎症的关键介质,从脂质条纹到成熟斑块破裂的病理过程中,都有ROS的参与。众多动物模型证实,ROS能够参与动脉粥样硬化和其他血管性疾病的病理过程。ROS可以通过促使基质金属蛋白酶的活化和LDL氧化修饰等加速动脉粥样硬化的发展。磷脂转运蛋白(phospholipid transfer protein, PLTP)是一个多功能的细胞外脂质转运蛋白。它能够在脂蛋白和细胞膜之间以及脂蛋白之间转运磷脂和维生素E。近来研究发现,PLTP与多种疾病关系密切。在炎症、肿瘤、神经系统病变、糖耐量及脂代谢异常等疾病的病理过程中,均有PLTP的参与。PLTP与动脉粥样硬化的关系也受到越来越多学者的关注。PLTP能够将胆固醇从巨噬细胞向胞外转移已得到众多文献的支持,而我们在前期研究中发现,过表达PLTP能够促进动脉粥样硬化的发展,而斑块中的脂质成分没有明显的改变。由此,我们提出如下假说PLTP能够促进巨噬细胞的氧化应激从而产生ROS,进而促进炎症因子的分泌和脂蛋白的氧化加速动脉粥样硬化的发展。建立一个好的动物模型尤其是相关基因的敲除小鼠模型,可以从体内直观的了解PLTP对动脉粥样硬化的影响,并对相关机制进行研究。为了进一步研究PLTP与动脉粥样硬化的关系,本研究首先建立PLTP与ApoE双基因敲除的小鼠模型(PLTP-/-ApoE-/-);在此基础上拟通过对已获取的两种基因鼠过表达PLTP腺病毒,观察PLTP对动脉粥样硬化斑块发展的影响,明确PLTP与动脉粥样硬化的关系,为动脉粥样硬化的干预寻找新靶点。目的1.探讨建立以ApoE-/-小鼠为背景的PLTP和ApoE双基因敲除小鼠动物模型的可行性；2.观察PLTP对动脉粥样硬化斑块发展的影响；3.探讨ROS在PLTP影响动脉粥样硬化斑块发展中的作用。方法1.构建PLTP-/-ApoE-/-(?)、鼠模型：自北京维通利华公司的ApoE-/-(?)、鼠和美国SUNY大学赠予的PLTP+/-小鼠进行基因型鉴定；将已鉴定的ApoE-/-小鼠和PLTP+／-小鼠按照雌性小鼠1只,雄性小鼠2只,雌雄分别来自不同亲代的原则合笼；待出生小鼠约4周龄时,将子代小鼠标记为F1代,分别将雌雄鼠分开,剪取脚趾用于标记编号,剪尾巴用于提取DNA；已经鉴定出的F1代中的双杂合子按照上述原则进行合笼,待繁育出F2代后同样进行标记鉴定；最后将双基因敲除鼠进行合笼,繁育出的后代中的雄性小鼠用于后续实验。2.体内试验：2.1动物实验流程：将8周龄的雄性小鼠按基因型及干预措施不同分为四组：ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组(n=18)；ApoE-/-小鼠+Ad-PLTP组(n=18)；PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组(n=16)；PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-PLTP组(n=16)。所有小鼠均给予全程高脂饲料(0.25%胆固醇+15%脂肪)喂养,高脂喂养8周后,给予尾静脉注射病毒。病毒转染2周后,麻醉处死小鼠,收取标本。2.2血脂和血清炎症因子的测定：实验结束,立即采取小鼠腹腔静脉血,留取血清分装后冻存于-80℃冰箱备用。采用酶法检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C))浓度；采用ELISA的方法,检测血清中MCP-1、TNF-α、IL-6的浓度。2.3病理学检查：大体油红O染色检测主动脉斑块生长情况；主动脉根部冰冻切片做HE染色(斑块形态)、油红O染色(脂质含量)；并通过免疫组化染色检测斑块中SMC、MOMA-2、MCP-1、ICAM-1及MMP9蛋白的表达情况。2.4斑块内ROS的测定：将液氮冷冻保存的主动脉根部解冻后匀浆处理,然后加入10μmol/L的DCFH-DA,避光条件下37℃孵育30分钟,PBS洗3遍后用荧光酶标仪检测。3.体外实验：3.1腹腔巨噬细胞的培养：实验3天前将3%的疏基乙酸钠注入小鼠腹腔中,诱导巨噬细胞的产生。无菌环境下剪开小鼠腹膜,收集腹腔巨噬细胞,采用差时贴壁的方法,筛选出腹腔巨噬细胞。采用免疫荧光的方法,用抗MOMA-2的抗体鉴定提取的原代巨噬细胞。3.2实验分组：3.2.1为了观察PLTP对不同来源细胞ROS、LDL氧化能力及细胞炎症相关因子的影响,根据选取的腹腔巨噬细胞来源及干预措施不同分组：ApoE-/-+Ad-GFP组;ApoE-/-+Ad-PLTP组;PLTP-/-ApoE-/-+Ad-GFP组;PLTP-/-ApoE-/-+Ad-PLTP组。3.2.2为了观察ROS是否参与PLTP引起的炎症因子表达的变化,根据有无抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)及PLTP腺病毒干预,将RAW264.7细胞分组：空白对照组,Ad-PLTP组,NAC组和Ad-PLTP+NAC组。3.3细胞内ROS水平的测定：按1：1000用无血清培养基稀释DCFH-DA,加入到已用PBS冲洗的细胞培养孔中,避光条件下37℃孵育20分钟。用无血清培养基洗涤3次,荧光酶标仪488nm激发波,525nm发射波下观察结果。3.4巨噬细胞对LDL氧化能力的测定：在干预的细胞内加入LDL,采用检测丙二醛(MDA)的方法评估LDL的氧化情况。3.5蛋白印迹分析：干预终末,收集细胞,提取细胞蛋白,检测MCP-1、ICAM-1及MMP-9蛋白的表达。3.6明胶酶谱：提取干预后的巨噬细胞蛋白,测定蛋白浓度后,用明胶酶谱法测定细胞内MMP-9的活性。结果1.双基因敲除鼠鉴定结果经过多代合笼杂交后,获得PLTP-/-ApoE-/-双基因敲除小鼠模型。根据电泳条带,判读小鼠的基因型。PLTP基因结果判读：在240bp处有一明亮条带的是基因敲除小鼠(PLTP-/-),在300bp处有一明亮条带的是野生型小鼠(PLTP+/+),在240bp及300bp处有两条带的是杂合子小鼠(PLTP+/-)；ApoE基因结果判读：在243bp处有一条明亮条带的是基因敲除小鼠(ApoE-/-),在155bp处有一条明亮条带的是野生型小鼠(ApoE+/+),在155bp和243bp处有两条带的是杂合子小鼠(ApoE+/-)。2.体内试验2.1各组基因鼠血脂及体重指标的变化：血脂测定结果显示,各组小鼠TC、TG(?)(?)LDL-C差异无统计学意义(P>0.05),而血脂中HDL-C出现了明显的组间差异：与ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组比较,ApoE-/-小鼠+Ad-PLTP组和PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组的HDL-C水平均明显降低(P<0.05),而PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-PLTP组与PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组比较,HDL-C水平明显升高(P<0.05)。小鼠体重的检测结果显示,与ApoE-/-小鼠相比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠体重明显降低(P<0.05),并且转染PLTP腺病毒对小鼠的体重无明显影响。2.2各组基因鼠血清中炎症相关因子的差异：与ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组的MCP-1浓度显著降低(P<0.05)；ApoE-/-小鼠组和PLTP-/-ApoE-/-(?)鼠组血清中MCP-1浓度在转染PLTP腺病毒后均明显升高(P<0.05)。血清中的IL-6在各组小鼠中也出现类似的变化,但是,与ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组比较,ApoE-/-小鼠在转染PLTP腺病毒后血清中IL-6的水平无明显变化。各组小鼠血清中的TNF-α未见显著的差异(P>0.05)。2.3各组基因鼠动脉粥样硬化斑块生长情况：动物大体拍照直观显示,与ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组颈动脉斑块分布明显减少；与转染空病毒组相比较,在转染PLTP腺病毒后,ApoE-/-小鼠和PLTP-/-ApoE-/-小鼠的颈动脉斑块生长更加明显。主动脉的大体油红O染色结果显示：与ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组的动脉粥样硬化斑块负荷明显减少(P<0.05)；转染PLTP(?)泉病毒后,ApoE-/-小鼠和PLTP-/-ApoE-/-小鼠的斑块负荷均较对照的空病毒组明显增加(P<0.05)主动脉根部HE染色斑块中的结果显示,与ApoE-/-小鼠组比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠组的动脉粥样硬化斑块面积明显减小(P<0.05)。与空病毒组比较,在转染PLTP腺病毒后,ApoE-/-小鼠的斑块面积明显增加(P<0.05)。同样,与转染空病毒比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠转染PLTP月病毒后斑块面积也显著增加(P<0.05)2.4各组小鼠主动脉根部斑块成分的病理分析：各组基因鼠的脂质含量未见明显的统计学差别(P>0.05)。与ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组斑块中巨噬细胞的含量明显减少(P<0.05)；与转染空病毒比较,ApoE-/-小鼠和PLTP-/-ApoE-/-小鼠转染PLTP腺病毒后,巨噬细胞的含量明显增加(P<0.05)。平滑肌细胞的含量在各个组之间未见明显的统计学差异(P>0.05)。2.5各组基因鼠动脉粥样硬化斑块中MCP-1、ICAM-1和MMP-9蛋白表达的差异：与ApoE-/-小鼠+Ad-GFP比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组斑块中MCP-1、ICAM-1和MMP-9含量明显减少(P<0.05)；与转染空病毒比较,转染PLTP腺病毒后,ApoE-/-小鼠和PLTP-/-ApoE-/-小鼠主动脉根部斑块中MCP-1、ICAM-1和MMP-9含量均显著升高(P<0.05)2.6各组基因鼠斑块中ROS的差异：与ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组比较,PLTP-/-ApoE-／-小鼠+Ad-GFP组斑块中ROS的含量显著减少(P<0.05)；与转染空病毒比较,转染PLTP(?)泉病毒后,ApoE-/-小鼠和PLTP-/-ApoE-/-小鼠斑块中ROS的含量均明显升高(P<0.05)。3.体外实验3.1腹腔巨噬细胞鉴定：采用免疫荧光的方法,鉴定腹腔巨噬细胞的纯度大于95%。3.2PLTP对巨噬细胞内ROS的影响：与ApoE-/-+Ad-GFP组比较,PLTP-/-ApoE-/-+Ad-GFP组的ROS水平明显降低(P<0.05)；与转染空病毒组比较,ApoE-/-鼠和PLTP-/-ApoE-/-鼠来源的腹腔巨噬细胞在转染PLTP腺病毒后ROS的含量明显升高(P<0.05)。3.3PLTP对巨噬细胞氧化LDL能力的影响：与ApoE-/-+Ad-GFP组比较,PLTP-/-ApoE-/-+Ad-GFP组的MDA含量显著减少(P<0.05)；与转染空病毒组比较,ApoE-/-鼠和PLTP-/-ApoE-/-鼠来源的腹腔巨噬细胞在转染PLTP腺病毒后氧化LDL的能力明显增强,MDA的含量明显升高(P<0.05)。3.4PLTP对巨噬细胞内MCP-1、ICAM-1和MMP-9蛋白表达及MMP-9活性的影响：两种不同基因鼠来源的腹腔巨噬细胞在转染PLTP腺病毒后,MCP-1、ICAM-1和MMP-9蛋白的含量明显增加(P<0.05)；与ApoE-/-+Ad-GFP组比较,PLTP-/-ApoE-/-+Ad-GFP组的MCP-1、ICAM-1和MMP-9蛋白的含量显著减少(P<0.05)。MMP-9的活性在各个组的结果与MMP-9蛋白表达一致。3.5NAC在PLTP引起的炎症反应中的作用：与对照组比较,Ad-PLTP组的MCP-1、ICAM-1和MMP-9蛋白的含量明显增加(P<0.05),NAC组无明显变化(P>0.05)。与Ad-PLTP组比较,Ad-PLTP+NAC组MCP-1、ICAM-1和MMP-9蛋白的含量显著减少(P<0.05)。结论1.通过杂交的方法可以构建得到PLTP-/-ApoE-/-双基因敲除小鼠,并且这个动物模型能够用来研究PLTP与动脉粥样硬化斑块的关系；2.与ApoE-/-小鼠比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠发生动脉粥样硬化的程度明显减弱,进一步证实了PLTP与动脉粥样硬化的关系；3. PLTP可以通过巨噬细胞ROS影响LDL的氧化和炎症因子的产生,促进动脉粥样硬化的发展。背景：心脑血管病是当前危害人类健康的“头号杀手”,动脉粥样硬化斑块破裂导致的血栓形成是急性心脑血管事件的主要原因。多种因素可使稳定斑块变为不稳定斑块,并触发斑块的破裂,但是有关斑块不稳定和破裂的机制尚未完全明了,动脉粥样硬化斑块易损性的研究仍然是国内外研究的热点。深入研究斑块不稳定的发生机制,干预其相关因素,将为临床预防急性心血管病事件提供理论依据和新的干预靶点。成熟斑块中巨噬细胞的凋亡,是影响动脉粥样硬化斑块稳定性的一个重要病理过程。巨噬细胞凋亡后形成的细胞碎片使得斑块内炎症加重、单核细胞招募增多,促进更多的泡沫细胞形成。随着斑块的生长,泡沫化的巨噬细胞在坏死核和斑块的肩部聚集增多,这些细胞产生并释放基质金属蛋白酶,降解斑块内的胶原成分,减少纤维帽的厚度,破坏斑块的结构,促使斑块变得更加不稳定。JAK激酶(Janus-activated kinase, JAK)可以与下游的信号转导和转录活化因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)发生信号偶联,调控细胞的功能。JAK/STAT信号通路在细胞的凋亡中扮演重要角色。有研究提到,JAK2在过氧化氢诱导的平滑肌细胞凋亡中发挥重要作用,这种作用可以被JAK2的抑制剂AG490抑制。我们前期的实验证实,磷脂转运蛋白(phospholipid transfer protein, PLTP)能够促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的发展。然而,PLTP对已形成斑块的稳定性是否有影响以及PLTP通过什么机制参与调控斑块的稳定性尚未见报道。有关PLTP与细胞信号传导通路的研究较少。有研究发现PLTP能够绑定到ATP结合盒转运子Al(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1),模拟载脂蛋白激活JAK2,从而促进脂质的流出。还有研究提到,PLTP能够扩大富含甘油三酯脂蛋白引起的细胞凋亡。基于既往研究,为了进一步明确PLTP对动脉粥样硬化斑块稳定性及其作用机制,我们提出如下假说：PLTP可能通过促进巨噬细胞的凋亡影响动脉粥样硬化斑块的稳定性,而JAK2-STAT信号通路可能是其作用的细胞机制之一。目的：1.明确PLTP对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响；2.探讨PLTP对巨噬细胞凋亡的作用,并探讨其可能的机制。方法：1.体内试验1.1动物实验流程：将8周龄的雄性小鼠按基因型及干预措施不同分为四组：ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组(n=16);ApoE-/-小鼠+Ad-PLTP组(n=16);PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组(n=16)；PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-PLTP组(n=16)。所有小鼠均给予全程高脂饲料(0.25%胆固醇+15%脂肪)喂养,在高脂喂养两周后行右侧颈动脉套管手术,以诱发动脉粥样硬化斑块病变。手术8周后,根据分组,经尾静脉注射病毒干预各组小鼠。两周后,麻醉处死小鼠,收取标本。1.2血脂和体重的测定：实验结束,立即采取小鼠腹腔静脉血,留取血清分装后冻存于-80℃冰箱备用。采用酶法检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度。1.3病理学检查：颈动脉冰冻切片做HE染色(斑块形态)、天狼猩红染色(胶原含量)、油红O染色(脂质含量)；并通过免疫组化染色检测颈动脉斑块中SMC、MOMA-2、MCP-1、ICAM-1、MMP-9及RIP3蛋白的表达情况。根据公式计算斑块的易损指数,易损指数=(巨噬细胞的阳性面积百分比+脂质的阳性面积百分比)／(平滑肌细胞阳性面积百分比+胶原阳性面积百分比)。通过Image-Pro Plus6.0图像分析软件来测量斑块中纤维帽的厚度、帽核比值、内膜-中层厚度和斑块面积。1.4凋亡相关指标的检测：采用免疫荧光的方法,检测小鼠斑块中cleaved caspase-3的表达；用TUNEL的方法,检测小鼠斑块中细胞的凋亡情况；采用免疫荧光和TUNEL法共定位凋亡细胞的类型。2.体外实验2.1腹腔巨噬细胞的培养：同论文Ⅱ。2.2实验分组：2.2.1为了观察PLTP对腹腔巨噬细胞中JAK2-STAT1/3、RIP3和cleaved caspase-3的影响,根据选取的腹腔巨噬细胞来源及干预措施不同分组：ApoE-/-+Ad-GFP组；PLTP-/-ApoE-/-+Ad-GFP组;ApoE-/-+Ad-PLTP组;PLTP-/ApoE-/-+Ad-PLTP组。2.2.2为了观察JAK2-STAT3信号通路是否参与调控PLTP对cleaved caspase-3产生的影响,将RWA264.7细胞分为4组：空白对照组(Ad-GFP); Ad-PLTP组;AG490组;Ad-PLTP+AG490组。2.2.3为了观察PLTP在调控cleaved caspase-3蛋白表达时,RIP3及ROS是否参与其中,按照加入RIP3siRNA和Ad-PLTP的不同,将RWA264.7细胞分为4组：空白对照组(Ad-GFP), Ad-PLTP组,RIP3siRNA组,Ad-PLTP+RIP3siRNA组。根据有无抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)及PLTP腺病毒干预,将RAW264.7细胞分组：空白对照组；Ad-PLTP组；NAC组；NAC+Ad-PLTP组。2.3蛋白印迹分析：干预终末,收集细胞,提取细胞蛋白,检测cleaved caspase-3, p-JAK2, p-STAT3及RIP3蛋白的表达。2.4细胞内ROS水平的测定：同论文Ⅱ。结果：1.体内试验1.1各组基因鼠血脂及体重指标的变化：血脂测定结果显示,各组小鼠在TC、TG和LDL-C方面没有明显的差异(P>0.05),而血脂中HDL-C出现了明显的组间差异：与ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组比较,ApoE-/-小鼠+Ad-PLTP组HDL-C水平明显降低(P<0.05)；与ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组HDL-C水平明显降低(P<0.05)；与PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-GFP组比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠+Ad-PLTP组HDL-C水平明显升高(P<0.05)。小鼠体重的检测结果显示,与ApoE-/-小鼠比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠体重明显降低(P<0.05),转染PLTP腺病毒对小鼠的体重无明显影响。1.2各组基因鼠颈动脉斑块生长情况：HE染色在颈动脉斑块中的结果显示,与ApoE-/-小鼠组比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠组的动脉粥样硬化斑块面积明显减小(P<0.05)。与空病毒组比较,在转染PLTP腺病毒后,ApoE-/-(?)、鼠的斑块面积显著增加(P<0.05)。同样,与PLTP-/-ApoE-/-小鼠转染空病毒相比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠转染PLTP腺病毒后的斑块面积也显著增加(P<0.05)。1.3各组小鼠颈动脉斑块形态学特征比较：用图像分析软件(Image-Pro Plus6.0software)测量选定指标,结果显示,ApoE-/-小鼠和PLTP-/-ApoE-/-小鼠在转染PLTP腺病毒后,纤维帽厚度明显变薄,内膜中层厚度显著增厚,帽核比值显著减小(P<0.05)；与ApoE-/-小鼠组比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠组的纤维帽厚度变大,内膜中层厚度减小,帽核比值增大(P<0.05)。1.4各组小鼠颈动脉斑块成分的病理分析：与ApoE-/-(?)、鼠组比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠组颈动脉斑块中胶原含量显著增加,巨噬细胞含量明显减少,平滑肌细胞数量显著增加(P<0.05)。与转染空病毒比较,ApoE-/-小鼠和PLTP-/-ApoE-/-小鼠在转染PLTP腺病毒后胶原含量显著减少,巨噬细胞含量明显增加,平滑肌细胞含量明显减少(P<0.05)。脂质含量在各组基因鼠中,未见明显的统计学差异(P>0.05)。易损指数计算结果显示：与ApoE-/-小鼠组比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠组的易损指数显著降低(P<0.05)；转染PLTP腺病毒后,ApoE-/-小鼠组和PLTP-/-ApoE-/-小鼠组的易损指数均明显升高(P<0.05)1.5各组基因鼠斑块中MCP-1、ICAM-1和MMP-9蛋白的差异：与ApoE-／-小鼠组比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠组颈动脉斑块中MCP-1、ICAM-l和MMP-9含量明显减少(P<0.05)。转染PLTP腺病毒后,ApoE-/-小鼠和PLTP-/-ApoE-/-小鼠颈动脉斑块中MCP-1、ICAM-1和MMP-9含量均显著升高(P<0.05)。1.6各组小鼠斑块中凋亡细胞的定位及凋亡相关指标的检测：采用TUNEL法测定细胞的凋亡情况,结果显示,与ApoE-/-小鼠组比较,PLTP-/-ApoE-/-小鼠组的细胞凋亡显著减少；在转染PLTP腺病毒后,ApoE-/-小鼠和PLTP-/-ApoE-/-小鼠斑块中凋亡细胞明显增加。凋亡细胞与巨噬细胞共定位结果显示,各个组细胞的凋亡主要发生在巨噬细胞分布的部位。PLTP-/-ApoE-/-小鼠组斑块中RIP3和cleaved caspase-3蛋白的表达明显低于ApoE-/-小鼠组(P<0.05)。与转染空病毒比较,ApoE-/-小鼠和PLTP-/-ApoE-/-小鼠在转染PLTP腺病毒后,颈动脉斑块中RIP3和cleaved caspase-3含量明显升高(P<0.05)。2体外实验2.1腹腔巨噬细胞鉴定结果：采用免疫荧光的方法,鉴定腹腔巨噬细胞的纯度均大于95%。2.2PLPT对cleaved caspase-3表达的影响：与ApoE-/-+Ad-GFP组比较,PLTP-/-ApoE-/-+Ad-GFP组cleaved caspase-3的表达明显减少(P<0.05)；与ApoE-/-+Ad-GFP组比较,ApoE-/-+Ad-PLTP组cleaved caspase-3的表达明显增加(P<0.05)；与PLTP-/-ApoE-/-+Ad-GFP组比较,PLTP-/-ApoE-/-+Ad-PLTP组cleaved caspase-3的表达明显增加(P<0.05)。2.3PLTP通过JAK2-STAT信号通路调节cleaved caspase-3表达：与ApoE-/-+Ad-GFP组比较,ApoE-/-+Ad-PLTP组JAK2-STAT1/3的磷酸化水平明显增强(P<0.05)；与PLTP-/-ApoE-/-+Ad-GFP组比较,PLTP-/-ApoE-/-+Ad-PLTP组JAK2-STAT1/3的磷酸化水平明显增强(P<0.05)；ApoE-/-+Ad-GFP组与PLTP-/-ApoE-/-+Ad-GFP组比较,JAK2一STAT3的磷酸化水平未见显著性差异,但是STAT1明显降低(P<0.05)。JAK2的抑制剂AG490能够显著的影响PLTP对cleaved caspase-3的作用：与对照组比较,Ad-PLTP组cleaved caspase-3水平明显升高(P<0.05)；AG490组对cleaved caspase-3的表达没有显著影响；Ad-PLTP+AG490组,PLTP引起的cleaved caspase-3升高受到抑制(P<0.05)。2.4PLTP可以通过影响RIP3/ROS来调控cleaved caspase-3表达：PLTP-/-ApoE-/-+Ad-GFP组与ApoE-/-+Ad-GFP组相比较,RIP3的表达明显减少(P<0.05)；ApoE-/-+Ad-PLTP组与ApoE-/-+Ad-GFP组比较,RIP3的表达显著增加(P<0.05); PLTP-/-ApoE-/-+Ad-PLTP组与PLTP-/-ApoE-/-+Ad-GFP组比较,RIP3的表达明显增加(P<0.05)RIP3siRNA干预细胞后,能够显著的抑制PLTP引起的cleaved caspase-3升高,而单用RIP3siRNA与对照组比较,cleaved caspase-3没有显著的改变(P>0.05)。与对照组相比较,单用NAC后,cleaved caspase-3没有显著的改变(P>0.05)。但是能够明显的抑制PLTP引起的cleaved caspase-3升高(P<0.05)RIP3siRNA能够显著的抑制PLTP引起ROS的的产生(P<0.05),而单用RIP3siRNA对ROS的产生无显著性影响(P>0.05)结论：1. PLTP可以增加动脉粥样硬化斑块的易损性,通过提高斑块中炎症反应和巨噬细胞的凋亡是PLTP促使斑块趋于不稳定的机制之一；2.PLTP可以通过上调JAK2-STAT1/3信号通路促进巨噬细胞凋亡；3.PLTP可以通过上调RIP3和ROS促进巨噬细胞凋亡。