霍乱弧菌CRP的碳源利用与甘露醇发酵转录水平的研究

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目的研究霍乱弧菌中CRP(cAMP receptor protein)调节蛋白、环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein CRP)对高丝氨酸脱氢(homoserine dehydrogenaseisozymes, HDH)是否具有调控作用。 CRP蛋白在调节多个通路,特别是在碳源代谢中发挥重要作用,同时CRP-cAMP亦调控着霍乱弧菌甘露醇mtl操纵子,其中mtl操纵子主要是霍乱弧菌O1群El Tor型产毒株(主要为甘露醇慢发酵株)和非产毒株(主要为甘露醇快发酵株)的调控因子。研究霍乱弧菌甘露醇发酵基因mtlA、mtlD转录水平差别,用实验数据证实两种类型菌株对甘露醇发酵快慢的原理。在试验中比较霍乱弧菌El Tor型的产毒株与非产毒株两类菌株在甘露醇发酵液试验中操纵子基因mtA、mtlD的RNA转录水平差异,它是否普遍存在于不同年代和不同地区的菌株中,及其蛋白表达是否也具有相同的差异性。方法采用基因搭桥与菌株构建的方法。通过搭桥PCR将HDH基因启动子中CRP潜在结合位点替换为CRP保守结合位点,分别将替换前后的启动子序列导入报告质粒,转化到野生珠C7258及CRP缺失株WL7258中比较冷光值的差异。霍乱弧菌中mtl基因簇调控甘露醇发酵的结构基因是mtlCBA,检测不同年代与不同地区的菌株,对24株甘露醇快发酵菌株和24株甘露醇慢发酵菌株在甘露醇发酵液中提取RNA,选取3个时间点(0.5h,2h,4h)检测mtlCBA基因转录,用Real-time荧光定量PCR的方法,比较两类菌株中甘露醇操纵子mtA,mtlD基因转录水平在培养发酵液过程中RNA的差异。另外,利用WB(western)实验技术,提取总蛋白,观察两类菌株mtlD基因在甘露醇发酵液中的蛋白表达差异。结果改造前报告质粒在野生株中的冷光值高于CRP缺失株,改造后报告质粒的冷光值在两株菌中均有升高,但在野生株中的升高值更为明显。试验中随机挑选24株甘露醇慢发酵株和24株甘露醇快发酵株,检测这两种类型的菌株在甘露醇发酵试验中,甘露醇操纵子mtlCBA的RNA转录水平的差异,经比较, RNA转录水平在早期,甘露醇快发酵株mtlCBA高于甘露醇慢发酵株;且甘露醇快速发酵株的操纵子mtlD基因蛋白表达量也高于甘露醇慢发酵株。结论霍乱弧菌的受体蛋白CRP调控HDH的转录,但不是唯一调控因子,霍乱弧菌两种菌株甘露醇PTS操纵子的转录差异,是启动子活性水平流行和非流行株甘露醇发酵菌株差异的原因。
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