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研究背景：艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(HIV, Human Immunodeficiency Virus)感染导致的全身免疫缺陷性疾病,目前尚无有效的疫苗可以预防HIV的感染。2010年全球HIV感染存活人数3400万,同时,流行病学调查显示50%的HIV感染者合并有丙型肝炎病毒(HCV)感染。由于HIV和HCV检测方法的准确度和灵敏度不断提高,HIV和HCV的病原检测与诊断取得了重大进展。如能够同时检测HIV抗体和P24抗原的第四代酶联免疫试验(ELISA)试剂盒,将进一步降低了血液筛查检测窗口期。实时荧光定量PCR检测技术作为辅助检测手段,使得HIV和HCV的核酸检测同时达到定性及定量效果。免疫印迹(WB)试验仍然是敏感度最高、特异性最好的HIV感染确证实验方法。但是,由于ELISA检测的非特异性及WB检测高耗时、高成本性,我们仍需要研发一种新的高敏感度和特异性、低成本、高通量和快速的HIV和HCV检测方法,一种适用于发展中国家和不发达国家的HIV和HCV检测技术。纳米科技为研发一种新的高通量HIV和HCV同时快速检测技术提供了重要的手段。目前,各种基于纳米科技的基因和蛋白芯片的高度集成化、自动化的新型检测技术正在不断涌现。其中基于纳米材料和纳米科技的微流控芯片技术正在被逐渐应用到分析检测领域,并发展到HIV和HCV检测领域。这种微流控芯片检测技术具有高敏感度、高特异性、高通量、经济和快速的特点,既适用于大规模的血液筛查也适用于确证病毒的感染,因此具有广阔的应用和发展前景研究目的：本研究利用纳米材料聚二甲基硅氧烷(PDMS, polydimethylsiloxane)制作微流控芯片。利用微流控芯片的微通道中流体特殊的物理特性及PDMS材料的表面吸附性,在微流控芯片微管道系统的微反应区域完成抗原抗体的反应,对血浆中的HIV、HCV抗体进行定性、半定量分析,以评价微流控芯片检测系统对血浆样本中HIV和HCV抗体定性检测的效果,探索检芯片检测的优势和检测条件。并通过检测大量血浆样本及与WB检测方法的比对,验证该方法的稳定性及准确度。研究方法：利用软刻蚀技术将光刻胶按照AutoCAD设计的尺寸与形状印制在硅片上,将液态PDMS与固化剂的混合物倒入后固化形成芯片。利用相同的PDMS材料在平板上固化形成厚度均一的基片。组装带通道的芯片与基片后,利用芯片微通道引入HIV和HCV的多种抗原并将其包被在基片上,然后经垂直交叉的芯片通道引入待测血浆样本及各种对照样品,基片上包被的多种抗原捕获样本中待测的目标抗体,将荧光素标记的二抗滴加在通道交叉区域,反应一定时间后,荧光显微镜下观测结果。反应微区域荧光强度(光密度)与样本中的目标抗体含量相关。Image Pro Plus6.0图像处理软件分析各反应点荧光强度,通过与阳性对照、阴性对照对比,按cutoff值对样本中目标抗体进行定性或定量。研究结果：1.利用HIV和HCV重组抗原及单克隆抗体,进行微流控芯片检测系统的分析敏感度试验。结果显示,各反应区域荧光强度与检测样本中目标单克隆抗体浓度成正相关,包被抗原后无封闭条件下微流控检测系统检测单克隆抗体的敏感度达10ng/mL。2.检测梯度浓度的单克隆抗体,建立抗体浓度-荧光亮度(光密度)剂量反应曲线。结果显示,抗体浓度与荧光强度之间具有较好的相关性(P<0.01),相关系数达0.99。3.利用微流控芯片检测系统重复检测固定的HIV阳性血浆样本,测试该检测系统的精密度和可重复性试验。不同时间重复检测4次的数据进行数据组内及组间精密度和组间一致性分析,平行检测15个点,重复4次的检测数据组内变异系数分别为27%、27%、27%和30.8%,组间变异系数为6.2%,4次重复试验荧光强度组间无显著性差异(p>0.05)。4.利用微流控芯片检测系统检测120份血浆样本中HIV抗体,检测结果与原始记录符合率达100%,即检测准确度为100%；经国产及进口ELISA试剂盒检测和核酸检测过的160份血浆样本进行HCV抗体检测,检测准确度为90.6%,存在漏检和错检样本；另外,利用本检测系统对29份HIV、HCV共感染血浆样本进行检测,检测结果符合率达100%。5.为验证本检测系统在确证HIV感染上的能力,对共计10份HIV强阳性、弱阳性及阴性样本同时进行WB检测和微流控检芯片检测,微流控检测结果与WB检测结果在所有样本各检测指标上的符合率为80%。研究结论1.基于纳米技术的微流控芯片检测系统在HIV、HCV抗体检测中具有可行性,检测的敏感度(10ng/ml)和可重复性较高(组间变异系数6%),而精密度有待改进(组内变异系数27%)。2.微流控芯片检测系统检测血浆样本中HIV时的准确度比检测HCV的准确度高(100%和90%),一方面来源于样本质量的影响,另一方面来源于包被抗原质量的差异。3.微流控芯片检测方法与WB检测相比,检测结果具有较高的一致性(80%),能够检测出WB检测不确定的样本。微流控芯片检测系统用作HIV感染的确证实验具有一定的可行性。4.微流控检测既有应用在血液筛查时需要的高敏感度、高通量、速度快的优点,又具有应用于HIV确诊时需要的低成本、高特异性的特点,具有广阔的应用前景,特别是在发展中国家及不发达国家。但是,该系统仍然存在样本引入困难,定量检测结果可重复性较低等缺陷,因此,要应用到血液检测的实际工作中,还需要不断改进。