Sfi1p功能性多肽与Cdc31p作用的研究

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大分子与大分子、大分子与小分子之间的相互作用是生命过程中生物信息调控的主要方式之一,当它们发生异常作用时则会影响生命体正常的生长和繁殖。在生物体中,蛋白质作为生命活动的执行者,是生物体中相当重要的大分子。   其中Sfilp是酵母细胞非常重要的蛋白,其与Cdc31p间的相互作用影响了酿酒酵母细胞的有丝分裂及减数分裂,是酵母细胞周期分裂过程中的一个关键蛋白。其内部结构由21个重复序列和20个间隔所组成,每一个重复序列的保守的氨基酸序列为LLX3F/LX2W,由此序列可知,苯丙氨酸(F)是一个较为保守的氨基酸,其对于Sfi1p与Cdc31p以1∶1摩尔比相互作用具有重要作用,且间隔序列的“弹性绳模型”为二者作用提供有利空间条件。因此可以说重复序列和间隔是Sfi1p重要的功能性结构。因此本论文通过对F分别突变为半胱氨酸(C)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、异亮氨酸(I)不同的氨基酸发现,突变为半胱氨酸后,第17个重复序列多肽的末端构象不同于突变为其它的氨基酸构象。究其原因为苯丙氨酸为芳香族氨基酸,分子量为165.19,而其它的氨基酸为脂肪族氨基酸,分子量较小,空间结构小,对多肽α螺旋结构骨架有影响导致其结构的改变。   随后,采用PCR技术克隆将664位苯丙氨酸突变为半胱氨酸的第17个重复序列基因序列,命名为sfi1/17;同样克隆Sfi1p的第17、18个重复序列的基因命名为SFI1/17-18及Cdc31p的全基因序列CDC31。并分别将其克隆至载体pGAD424和pGBT9上,构建载体pGAD424-sfi1/17、pGAD424-SFI1/17-18和pGBT9-CDC31。随后采用酵母双杂交技术发现突变的Sfi1/17多肽与Cdc31p不能发生相互作用,野生型Sfi1/17-18多肽可与Cdc31p发生相互作用,因此,将664位苯丙氨酸突变为半胱氨酸后影响了Sfi1p生物功能的正常发挥。   最后,本文还研究苯氧嘧啶类化合物和Taq DNA聚合酶的相互作用。通过用氟原子对化合物4-甲基-6-苯酚基-2-苯基-5-(3-(三氟甲基)苯基)嘧啶(简称4-MPPD)苯氧基上的氢取代改造得到化合物4-(4-氟苯酚基)-6-甲基-2-苯基-5-(3-(三氟甲基)苯基)嘧啶(简称4-FPPD)。通过PCR反应来比较4-FPPD、4-MPPD对PCR产物的影响,随后通过紫外和琼脂糖凝胶电泳测定4-FPPD、4-MPPD几乎对模板DNA没有作用,从侧面更进一步的证明4-FPPD对Taq DNA聚合酶作用的影响。
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