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基因治疗是人类治疗疾病的新方法,它将治疗基因导入患病的细胞或组织内代替或修复致病基因的缺陷,从而达到治疗疾病的目的。可用于治疗那些严重威胁人类健康和生命的疾病,如遗传病、恶性肿瘤等。其中,针对肿瘤的基因治疗已取得了实质性进展,并进入到临床应用阶段。基因治疗需要通过低毒高效的基因载体将治疗基因传送到靶细胞中。由于病毒载体存在很大的安全隐患,因此制备简单、可随意设计结构、免疫反应小的非病毒载体成为了人们研究的重点,特别是聚阳离子载体。然而,目前已有的非病毒基因传递系统往往缺乏特异性、转染效率偏低且细胞毒性较大,严重制约了它们在肿瘤基因治疗上的发展和应用。因此,本研究的目的是制备出一系列可用于肿瘤基因治疗的、功能更为全面的非病毒基因载体,它们具有如下功能：保护DNA免于核酸酶降解,具有显著的肿瘤靶向性,能协助DNA从内涵体中逃逸,可生物降解减小毒副作用。第一章介绍了基因治疗和基因载体的概况,基因传递过程中的障碍,常用非病毒基因传递系统的制备与应用,治疗型基因的种类。第二章中我们将生物素接到高分子量PEI(25 kDa)上,然后通过生物素-亲和素之间的生物特异性亲和作用,得到具有优异的生物相容性的新型基因载体生物素化聚乙烯亚胺／亲和素偶联物(ABP)。对该基因载体的各项生化性能进行了测试,包括ABP与DNA的结合能力,复合物的粒径、电位,体外细胞毒性和转染效率。结果表明,由于亲和素具有良好的生物相容性并与HepG2细胞之间存在特异性作用,因此ABP在HepG2细胞中显示出较低的毒性和较高的转染效率。本实验所制备的ABP是一种很有潜力的有肝癌细胞靶向性的基因载体。为了对第二章关于亲和素具有促进肝细胞靶向能力的推断进行验证,在第三章中我们继续在载体中引入亲和素,研究载体靶向肝癌细胞的能力。在本章实验中,我们首先通过双丙烯酰胱胺和800 Da PEI之间的迈克尔加成反应得到了可在细胞内还原降解的双硫键交联聚乙烯亚胺(PEI-SS)。然后将生物素接到PEI-SS上,并通过生物素-亲和素之间的生物特异性亲和作用,制备了新型生物素化双硫键交联聚乙烯亚胺／亲和素偶联基因载体(ABP-SS)。对ABP-SS及其ABP-SS／DNA复合物的各项性能进行了测试,包括材料的缓冲能力,与DNA的结合能力,复合物的粒径、电位,体外细胞毒性和转染效率。结果表明,ABP-SS可以在细胞内部的还原环境下降解并释放出DNA,提高载体的转染效率,减小细胞毒性。与PEI-SS相比,ABP-SS在HepG2细胞中的毒性更低,转染效率显著提高。这是因为ABP-SS中的亲和素组分具有良好的生物相容性并与HepG2细胞之间存在特异性作用。此外,采用荧光探针示踪的方法观察了不同细胞对ABP-SS／DNA复合物的内吞情况。结果表明ABP-SS有助于HepG2细胞对复合物的吞噬,因而对转染有促进作用。本实验所制备的ABP-SS是一种低毒高效的具有肝癌细胞靶向性的基因载体。在第三章中我们介绍了ABP-SS基因载体的制备方法和性能研究,结果表明该载体在HepG2细胞中有较高的转染效率和较低的细胞毒性。第四章进一步研究了实验条件对ABP-SS／DNA复合物在HepG2细胞中的转染效率和细胞毒性的影响,包括pH值、血清、NaCl、复合温度和时间等,从而寻找到ABP-SS介导基因转染HepG2细胞的最佳实验条件。凝胶电泳实验结果表明,ABP-SS／DNA复合物可以在pH=7.4时形成紧密结构,而在较低的pH值下所形成得结构则较为松散。转染效率的高低依赖于培养基的pH值,在ABP-SS基因传递系统对HepG2细胞的转染中,培养基的最佳pH值为7.4。在150 mM NaCl溶液中形成的ABP-SS／pGL-3复合物的粒径略大于在去离子水中形成的复合物的粒径,且更有利于基因转染。含量较低的血清对转染效率没有明显影响,表明载体ABP-SS的安全性较好。ABP-SS／DNA复合物成功转染HepG2细胞的最佳复合温度为37℃,最佳复合时间为30 min,它们与分子运动以及聚集程度有密切关系。共聚焦显微观察结果表明ABP-SS对HepG2细胞的毒性作用与细胞凋亡有关。第五章将亲和素作为桥梁把生物素化转铁蛋白与可生物降解的生物素化PEI-SS连接起来,制备了新型肿瘤靶向性生物素化转铁蛋白／亲和素／生物素化PEI-SS偶联基因载体(TABP-SS)。将该载体与野生型p53肿瘤抑制基因复合得到肿瘤靶向治疗基因传递系统。根据TABP-SS在不同细胞中的体外细胞毒性实验和转染实验结果可知,TABP-SS在HepG2和HeLa细胞中显示出相当低的细胞毒性和很突出的转染效率,这归因于载体上的转铁蛋白与肿瘤细胞上的转铁蛋白受体之间的特异性作用。只有在被转染的肿瘤细胞中才观察得到由p53基因转染而诱导产生的细胞凋亡特征。Western blotting免疫印迹法检测结果表明在COS7细胞中检测到的p53蛋白含量非常低,而HepG2和HeLa细胞中的p53蛋白表达量却相当高。此外,被T1ABP-SS介导的p53基因转染的细胞显示出最高的p53蛋白表达。因此,上述结果清楚地表明TABP-SS／p53基因传递系统具有毒性低、可生物降解、肿瘤特异性以及转染效率高的特点,可用于肿瘤的靶向基因治疗。