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研究背景胃癌是人类消化系统最常见的肿瘤之一,在全球范围内,胃癌的发病率和死亡率分别排在第五和第三位。手术被认为是目前唯一的根治性治疗方法。随着手术技术的进步和放疗、化疗、新辅助治疗的实施,胃癌的5年生存率有所提高。但是,由于早期胃癌缺乏特异性症状,早期诊断率低,大多数患者在确诊时已是晚期。许多患者在确诊后就无法手术,或在根治性胃切除术后复发,预后不良。因此,在早期阶段利用有效的筛选方法进行检测、选择合适的治疗方案和有效的监测,是降低死亡率的关键。虽然已有大量关于分子标志物的研究,但在临床使用中仍存在很大的局限性。开发常规、非侵入性、高度特异性、能够早期检测的生物标志物,已迫在眉睫。近十年来,临床上已逐步推广抗肿瘤免疫治疗,如溶瘤病毒、嵌合抗原受体 T 细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-Ts)、双特异性抗体和免疫检查点抑制剂等。但是,影响免疫治疗的相关因素尚未完全阐明。目前,虽然已经初步明确,肿瘤患者总体的免疫学状态以及肿瘤局部浸润免疫细胞特征,不但可以直接影响肿瘤患者的预后生存,也是决定肿瘤免疫治疗效果的重要因素。但是,胃癌患者总体免疫学特征以及免疫微环境中浸润免疫细胞特征尚未系统阐述。本研究拟从外周血免疫指标,免疫器官脾脏影像组学特征及肿瘤组织内浸润免疫细胞三个层面,探索及验证胃癌患者的免疫特征,并筛选对胃癌患者临床结局影响显著的免疫学指标,以期成为胃癌免疫治疗的潜在靶点,为胃癌的免疫治疗奠定基础。研究目的1.利用胃癌患者临床病理数据,分析外周血中淋巴细胞、血小板、中性粒细胞等免疫细胞数量及比值,建立评分系统,明确与胃癌患者临床病理特征及预后的关系。2.运用影像组学技术分析评估脾脏免疫器官的影像组学特征数据,并探究脾脏免疫器官相关特征与胃癌预后的相关性,尝试建立更为准确,适应性更广的预后预测模型,并明确其与胃癌患者生存预后的相关性。3.通过免疫组化检测胃癌标本中浸润免疫细胞特征,分析这些免疫特征与胃癌临床病理特征及预后的关系,明确胃癌肿瘤组织浸润免疫细胞特征改变及其对胃癌患者临床结局的影响。研究方法1.回顾性收集542例2012年1月至2016年12月期间,在温州医科大学附属第二医院接受择期胃癌根治术的患者,术前胃镜及病理确诊为胃癌。通过Kolmogorov-Smirnov检验,确定中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、血小板计数、血小板/淋巴细胞比率(platelet/lymphocyte ratio,PLR)和中性粒细胞与淋巴细胞比率(neutrophil/lymphocyte ratio,NLR)等连续参数的正态分布。采用卡方检验、独立t检验和Mann-Whitney U检验来检验临床病理特征与术前外周血PLR、NLR的关系。另外,采用卡方检验来检验胃癌患者临床特征与术后发生二级以上并发症的相关性。在单因素分析的基础上,采用多元logistic回归分析,计算出各自变量的比值比(odds ratio,OR)和95%置信区间(95%confidence interval,95%CI),明确胃癌患者术后发生二级以上并发症的独立危险因素。通过对每个变量的计算值求和来构建预测评分系统。使用临床诊断性能曲线(receiver operating curve,ROC)验证评分系统对比其他独立危险因素,对胃癌术后二级以上并发症的预测准确性是否提高。最后,用COX生存单因素及多因素分析影响胃癌术后生存的临床病理特征。2.回顾性收集243例在2014年12月至2016年12月期间,在温州医科大学附属第二医院就诊的可行根治性手术的胃癌患者,并且术前胃镜及病理确诊为胃癌。使用pyradiomics方法进行脾脏影像组学特征提取,在脾脏相关特征的筛选及预后模型的建立中,采取随机表法将243个患者1:1分为建模组和验证组(分别为124和119个患者)。在建模组中对所有833个特征进行COX回归分析,根据P值排序,取P值小于0.1的特征,进一步建立生存风险模型;验证组患者不参与特征的筛选及脾脏特征预后模型的建立,仅参与验证脾脏预后模型的准确性。建立脾脏预后模型后,汇总两组患者进行预后相关因素的单因素及多因素分析,建立可视化预后预测模型。3.回顾性收集475例自2006年12月至2011年12月期间,在温州医科大学附属第二医院行胃切除的胃癌手术患者的临床病理资料。本研究使用了含有475个胃癌组织标本的组织芯片。采用免疫组化方法分析6种淋巴细胞的特征(CD3+、CD4+、CD8+、CD20+、CD57+、FOXP3+)以检测胃癌中的肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)的变化。根据患者生存状态,使用 ROC曲线分析TILs浸润情况与临床病理特征之间的关系,将6个淋巴细胞特征及其比值分为高表达组和低表达组进行统计学分析。为了预测胃癌患者的生存期,采用LASSO逻辑回归模型来识别有用的淋巴细胞因子,并在建模组中构建一个综合评分TIL-Score。采用ROC曲线分析将淋巴细胞因子和TIL-Score分为两个不同的等级。采用卡方检验,分析TIL-Score与胃癌患者临床病理特征的相关性。生存分析采用Kaplan-Meier曲线分析,log-rank检验。采用Cox比例风险模型进行多元回归分析,构建列线图模型。列线图的预测效率采用校准曲线和ROC曲线进行测量。研究结果1.首次明确术前外周血PLR和NLR可用于预测胃癌术后并发症的发生。根据ROC曲线计算得出,二级以上并发症的PLR和NLR截断值分别设置为158.7和2.71。将患者分为高PLR、NLR组和低PLR、NLR组。发现PLR、NLR与年龄和肿瘤的某些临床病理特征密切相关。PLR、NLR升高与更大的肿瘤大小、更深的肿瘤浸润深度、溃疡型和淋巴浸润程度更高有关。ROC曲线显示,基于PLR的并发症联合预测模型,在所有术前预测指标中预测并发症的灵敏度和特异性最高。在生存分析中,高低PLR组和高低NLR组在各自的两组分组中存在明显的生存差异。在我们的研究中,PLR、NLR与年龄呈显著的相关性。PLR、NLR与其他临床病理特征的比较表明,PLR、NLR升高在较大的肿瘤大小、较迟的TNM分期、较高的查尔森合并症指数(Charlson comorbidity index,CCI)、较多的淋巴结转移及更深的浸润深度等方面均有统计学意义,更能反映胃癌的侵袭行为。本研究中,年龄、PLR、Charlson指数、肿瘤部位、腔镜手术和联合脏器切除在logistic回归模型中均有显著性意义。重要的是,该模型首次发现外周血免疫指标PLR,是胃癌术后短期并发症的独立预测因子。在长期生存方面,我们首次发现PLR、NLR、联合脏器切除、全胃切除、年龄和TNM分期是胃癌术后无病生存时间的独立危险因素。我们的评分系统结合了常见的年龄、PLR、Charlson指数、肿瘤部位、腔镜手术和联合脏器切除等指标建立一个可视化的联合预测模型,为术后短期并发症的发生提供可信的预测能力。2.使用pyradiomics方法进行脾脏影像组学特征提取,根据脾脏特征将患者分为两组。比较脾脏特征不同的两组基本资料(BMI指数、年龄、性别、高血压、糖尿病、NRS-2002评分、既往腹部手术史、肿瘤分化情况)均无统计学差异。但脾脏高危组和低危组在TNM分期上存在显著差异(P=0.03),脾脏高危组的TNM分期更倾向晚期。单因素分析提示:脾脏特征、年龄、营养风险筛查评分2002(nutritional risk screening score2002,NRS-2002)、美国麻醉师协会病情分级(American Society of Anesthesiologists Grade,ASA Grade)、Charlson评分、吻合方式和TNM分期与长期生存相关。多因素生存分析提示,脾脏特征高危组患者死亡风险比低危组高70%(HR=1.7,P=0.021)。TNM分期仍具有较高的预后预测价值,Ⅲ期患者的死亡风险是Ⅱ期患者的6.6倍(HR=6.6,P<0.001);Ⅱ期患者的死亡风险是Ⅰ期患者的2.1倍,但可能受限于样本量,结果不具有统计学意义(HR=2.1,P=0.144)。患者生存预后多因素COX分析中的其他独立危险因素如年龄(P<0.001)及吻合方式(P=0.007),对患者的术后生存结局也有显著影响。而基于独立危险因素建立的可视化列线图模型可以准确地预测胃癌患者术后1年或3年生存率。3.检测了包含475个胃癌组织的组织芯片中的CD3+、CD4+、CD8+、CD20+、CD57+和 Foxp3+TILs。Kaplan-Meier 分析显示,CD3+、CD4+、CD8+、CD20+、CD57+TILs浸润程度高与预后良好显著相关。FOXP3细胞浸润与胃癌患者生存率间,无明显相关性。为了构建和验证该模型,我们将患者随机分为FOXP3+建模组和验证组。利用6个淋巴细胞的特征及其比值,在建模组中通过LASSO逻辑回归方法,建立综合的生物标志物TIL-Score。在公式中,CD8+、CD3+、CD57+细胞和CD4+:CD8+比值、CD4+:CD3+比值、CD4+:CD20+比值、CD8+:CD57+比值、CD3+:FOXP3+比值为生存的保护因素,而FOXP3+细胞、CD4+:CD20+比值、CD8+:CD20+比值为生存的危险因素。进一步分析显示,TIL-Score高与建模组和验证组患者中的肿瘤体积较小、肿瘤浸润深度较浅、淋巴结转移较少、TNM分期较早相关。然而,在建模组和验证组中,TIL-Score与远处转移的关系并不一致。Kaplan-Meier生存分析和TIL-Score分布分析,均提示与胃癌患者的预后有良好的相关性。为了更好地预测胃癌患者的预后,我们构建了整合年龄、肿瘤大小、分化状态、TNM分期和TIL-Score的列线图。列线图曲线下面积大于0.8,提示准确性高。通过ROC曲线分析和校准曲线,对列线图进行了验证,在建模组和验证组中均显示了高度的一致性。决策曲线分析显示,在阈值概率为0.1-0.76的患者中,预测5年生存概率的列线图比treat-all组和treat-none组更准确。结论1.PLR、NLR可用于预测胃癌术后短期并发症和长期预后生存情况,从而指导个体化治疗。而PLR结合年龄、Charlson指数、肿瘤部位、腔镜手术和联合脏器切除等因素,可明显提高预测准确率。而且,这种新的评分系统是一种经济、方便的预测术后并发症的工具,对预防和诊治胃癌术后并发症具有重要意义。2.基于影像组学技术提取的脾脏特征,能够预测胃癌患者术后长期生存情况,其准确性经建模组和验证组一致确认。脾脏特征分组在一定程度上与肿瘤TNM分期相关。单因素及多因素分析提示:年龄、脾脏特征分组、TNM分期和吻合方式是生存预后的独立危险因素。而基于独立危险因素建立的列线图模型可以准确地预测胃癌患者术后1年或3年生存率,准确度高达78.7%,能为胃癌患者预后预测及治疗方案的制定,提供一定的价值。3.通过检测数个单一的TIL的特征及其比值,来建立综合性指标TIL-Score,然后构建一个整合TIL-Score和临床危险因素的TIL列线图,能更好地用于预测胃癌患者的预后。