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研究背景寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris,PV)是一类可致命的慢性自身免疫性大疱病,可累及全身皮肤和黏膜,其主要特征是机体产生针对桥粒芯糖蛋白3(Desmoglein 3,Dsg3)的致病性自身抗体,造成棘层松解和表皮内大疱形成。该病的发生发展与调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)介导的外周免疫耐受失衡密切相关。Treg细胞通过表达特异性叉状头转录因子(Forkhead box P3,FOXP3)抑制自体反应性辅助性T细胞(T-helper cell,Th)的过度活化,维持机体对自身抗原的免疫耐受。不少关于自身免疫性疾病的研究表明,微小RNA(microRNAs,miRNAs)可调控Treg细胞介导的免疫耐受过程,但目前甚少有关于miRNAs调控PV免疫耐受的研究报道。我们团队前期研究表明miR-338-3p在 PV 患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)内表达水平上升,且可影响抗Dsg3抗体的生成。然而,miR-338-3p对Treg细胞介导的外周免疫耐受的影响仍有待探讨。研究目的明确miR-338-3p在PV患者CD4+T细胞中的表达情况,分析miR-338-3p的临床意义,探究miR-338-3p对PV免疫耐受平衡的影响。研究方法1.qPCR检测PV患者与健康对照外周CD4+T细胞内miR-338-3p的表达水平,分析miR-338-3p水平与疾病严重程度的相关性,探讨miR-338-3p的临床意义;2.qPCR检测CD4+T细胞亚型(Treg/Th)相关的转录因子和细胞因子在PV患者和健康对照外周CD4+T细胞中的mRNA水平,了解PV患者Treg/Th细胞的免疫应答情况。通过GEO数据库获取PV患者CD4+T细胞的全基因组芯片数据,进行生物信息学分析进一步挖掘与免疫过程、免疫耐受相关的差异表达基因。3.应用TargetScan网站预测miR-338-3p的靶基因,从基因芯片分析的差异表达基因中筛选miR-338-3p的预测靶基因,并在本研究受试者的CD4+T细胞中进行表达验证。最后应用miRNA转染、双荧光素酶报告基因实验和流式细胞术探讨PV中miR-338-3p调控Treg细胞介导的外周免疫耐受的机制。研究结果1.miR-338-3p在疾病活动期的PV患者外周血CD4+T细胞中的表达水平较健康对照组明显升高,与抗Dsg3抗体滴度及天疱疮疾病区域指数(the Pemphigus Disease Area Index,PDAI评分)均呈正相关。糖皮质激素治疗2周后,病情改善患者的miR-338-3p水平较前显著下降,病情无明显改善者的miR-338-3p水平无明显变化。2.活动期PV患者CD4+T细胞内的FOXP3mRNA水平下降,RORC mRNA水平上调,提示Treg细胞介导的免疫抑制功能受损,而Th17细胞介导的炎症反应激活。PV患者CD4+T细胞芯片生物信息学分析结果表明,在PV患者和健康对照之间差异表达的基因与免疫反应密切相关,其中包括调节FOXP3基因表达的重要激活因子 RUNX1(Runt-related transcription factor 1)蛋白。3.miRNA靶基因预测提示RUNX1是miR-338-3p的靶基因,qPCR验证RUNX1 mRNA在PV患者CD4+T细胞中表达降低,其表达水平与FOXP3 mRNA水平呈正相关,但与miR-338-3p水平呈负相关。荧光素酶报告基因实验证实RUNX1是miR-338-3p的靶基因,miRNA转染结果表明miR-338-3p可抑制RUNX1和FOXP3基因的表达,引起Treg细胞抑制功能受损。结论1.miR-338-3p在PV患者CD4+T细胞中表达升高,其水平与病情严重程度平行,提示miR-338-3p可作为PV早期诊断和疗效评价的敏感标记物。2.PV患者外周Treg细胞介导的免疫抑制功能减弱,提示存在外周免疫耐受受损。3.在PV中过表达的miR-338-3p通过靶向RUNX1抑制CD4+T细胞内FOXP3的表达,导致Treg细胞介导的免疫抑制功能受损,因此miR-338-3p是修复PV免疫耐受失衡的潜在治疗靶标。