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遏制细菌耐药性行动计划(2016-2020)是全民的共识与国家的意志的体现,需要实施切实的技术措施。除了依据可靠的药敏试验结果精准用药外,噬菌体以其特异性强、与抗生素无交叉抗药性、无残留、对人畜无感染性、容易筛选获得等独特优势成为潜力巨大的选项。本文从山东省种鸡场、商品鸡场采集病料和粪样筛选大肠杆菌的流行菌株,完善药敏试验方法,预警抗药性菌株;筛选裂解性噬菌体,分析其生物学性质和基因结构,通过注射、口服方式进行治疗试验,以期控制种鸡场致病性大肠杆菌的感染和流行。使用麦康凯培养基从临床样品和粪样中筛选出疑似大肠杆菌,经大肠杆菌特异性引物phoA共鉴定出大肠杆菌株117株。多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)结果表明共有 65 个 ST 型,其中 ST155、ST156 与 ST69居多,另发现两个新ST型。线性梯度平板能精确地测定MIC,推算药物的原始浓度,能更好地保证质控试验的可靠性。当按照美国临床实验室标准委员会(Clinical Laboratory Standards Institute,CLSI)或欧盟药敏试验委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)的 S(Susceptible)、I(Intermediate)、R(Resistant)范围标准设置0-S、S-R、R-8R这样三个线性梯度,首先可以判断菌株敏感性范围及细菌群落精确的MIC值,并能分离出抗性菌株,预警该抗生素使用后可能出现的抗药性,进而指导临床药物的选择和应用。如果自动化生产即用型梯度平板,将便利临床药敏试验,改进抗药性筛选技术。以半固体双层平板噬菌斑法针对上述流行性耐药大肠杆菌共分离纯化到大肠杆菌噬菌体143株。挑选主要ST型菌株ST155对应的3株大肠杆菌噬菌体进行了测序和电镜观察,噬菌体均属于有尾目、肌尾科T4噬菌体类型,由二十面体头部与尾部组成,其中vB-EcolP-YSFl为新型噬菌体,与已测序噬菌体只有11%的相似性。vB-EcolP-XT4、vB-EcolP-RZⅢ与vB-EcolP-YSF1生物学特性分析表明,噬菌体效价均可达到10~9pfu/ml,且热稳定性较好,在60℃温度下保温1 h后噬菌体效价仍可达到10~7pfu/ml以上;最适生长温度均在37 ℃左右;在pH值为4-10的区间内能保持较好的裂解活性,最适pH偏中性;噬菌体的最佳感染复数一般在0.1-1之间,噬菌体在感染宿主菌后的潜伏期一般为20 min。通过大肠杆菌含有的毒力基因数目与其半数致死量确定攻毒菌株,以棋盘法试验优化最佳感染复数,确定大肠杆菌噬菌体vB-EcolP-YSF1与大肠杆菌E.YSF-1肝作用的最佳浓度比,噬菌体治疗采用胸肌注射肉鸡,表现出了较好的治疗效果,并随着噬菌体效价的提高,肉鸡的死亡率降低;噬菌体口服治疗SPF鸡实验采用同时口服噬菌体vB-EcolP-RZⅢ与高抗的致病性大肠杆菌,噬菌体治疗组比只口服致病菌组粪样中该高抗的致病性大肠杆菌降低了至少1个数量级,这在实际生产条件下具有良好的临床应用价值,为后期噬菌体治疗禽源大肠杆菌病奠定基础。未来将根据上述试验结果在种鸡场进行大肠杆菌大规模的环境净化与大肠杆菌病防治试验。