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肝癌在全球范围内都是一种发病率非常高的恶性肿瘤。由于肝癌早期患者无症状或者症状不明显,且早期肝癌的的诊断手段有限,大多数患者确诊时已经进入肝癌晚期,目前常用的治疗方法有手术、放化疗等,但是治愈效果并不理想,复发率高,5年生存率极低,一直以来肝癌都是困扰医学界的难题。分子靶向治疗能够有效作用于肿瘤特异性靶点,直接杀伤肿瘤细胞,对正常细胞无明显影响,现在已经成为医学界研究的热点,将来有可能会是一种有效治愈肿瘤的新方法。热休克蛋白是生物体内普遍存在的蛋白质,包含众多家族成员。热休克蛋白90(Heat Shock Protein 90,Hsp90)是其中重要的一员。Hsp90是细胞内一种重要的分子伴侣,参与200多种蛋白质的折叠装配,大多数的客户蛋白是癌蛋白。这些蛋白中许多都是细胞内重要的激酶、转录因子和参与体内信号通路的关键蛋白等。已有研究证明Hsp90在众多肿瘤细胞中高表达,而在正常细胞中的表达低下甚至不表达,所以许多科学家将其作为抗肿瘤治疗的分子靶点,特异性的干预Hsp90,通过其调节肿瘤信号通路上的关键位点达到治疗肿瘤的目的,正因如此,针对Hsp90抑制剂的研究成为抗肿瘤研究的焦点。多数Hsp90抑制剂是与Hsp90的N末端结合,与客户蛋白竞争N端的ATP结合位点,导致客户蛋白不能正确折叠,破坏其功能,进而中断其信号传导通路。最早发现的Hsp90抑制剂格尔德霉素(GM),是一种强有效的抗肿瘤药,但是因为肝毒性大而未能进入临床,它的衍生物相对改进了它的缺点,但是因为水溶性差同样使它的临床应用受到限制。有研究证明根赤壳菌素在体外有非常强的抗肿瘤活性,但是体内实验证明其没有活性,科学家对其进行结构改进后这一缺陷有所改观,它的衍生物无论体内还是体外均有抗肿瘤作用。Hsp90 C端抑制剂因为与Hsp90结合力较弱限制了它的临床应用,其衍生物改进了上述缺点,目前也正在研究过程中。KW-2478是一种新型的根赤壳菌素Hsp90抑制剂,它具有高水溶性、低肝毒性等优点。研究证明KW-2478对多发性骨髓瘤有很好的抗肿瘤活性。但是对实体瘤的作用目前未见相关文献报道,本研究着重于KW-2478对肝癌HepG2细胞的作用,并进一步探讨了该药物的作用机制,为KW-2478的进一步开发提供数据依据。目的:研究KW-2478对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭和衰老的影响,从分子水平深入探讨凋亡和周期的相关作用机制。方法:MTT法检测不同剂量、不同时间的KW-2478对肝癌HepG2细胞增殖的影响;流式细胞术检测不同剂量KW-2478作用于HepG2细胞48 h后凋亡和周期的变化;采用Transwell侵袭实验检测不同剂量KW-2478对肝癌HepG2细胞侵袭力的影响;β-半乳糖酐酶(SA-β-gal)染色检测KW-2478对HepG2细胞衰老的影响;western-blot和实时荧光定量PCR分别从蛋白和mRNA水平检测凋亡、周期及JAK-STAT3信号通路相关因子的变化。数据均使用SPSS 20.0进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.MTT实验结果显示KW-2478对肝癌HepG2细胞有明显的抑制作用,24 h的IC50为11.409 mg/L,48 h的IC50为4.230 mg/L,抑制作用与药物剂量和时间呈现正相关,且析因分析结果显示药物剂量与作用时间具有交互作用。KW-2478对HL-7702细胞无抑制作用,且药物剂量和时间无交互作用。2.流式细胞术实验结果显示不同剂量的KW-2478作用于HepG2细胞48 h后,能够有效促进肿瘤细胞凋亡,且凋亡率与药物剂量呈正相关。周期结果显示KW-2478能够阻滞HepG2细胞于G2期,并呈现剂量依赖性。3.Transwell侵袭实验结果显示KW-2478作用于HepG2细胞24 h后肿瘤细胞的侵袭力较对照组明显下降,并呈现剂量依赖性。4.SA-β-gal染色结果显示低剂量KW-2478能够促进HepG2细胞衰老,药物浓度1 mg/L时衰老细胞数占总细胞数的比例最高,继续增加药物浓度衰老细胞比例逐渐降低。5.采用western-blot检测KW-2478对HepG2细胞作用后,凋亡相关因子Bax、Caspase3、Caspase9和Caspase8表达上调,Bcl-2、Survivin、XIAP的表达下调,周期相关因子c-myc、CyclinA、CyclinB1、CyclinD1和CyclinE1的表达下调,且所有因子均与KW-2478的作用剂量呈现相关性。6.qPCR实验结果显示KW-2478对HepG2细胞作用后,相关凋亡因子Caspase3、Caspase9和Caspase8表达上调,Bcl-2、XIAP的表达下调,周期相关因子c-myc、CyclinA、CyclinB1、CyclinD1和CyclinE1表达下调,且所有因子均与KW-2478的作用剂量呈现相关性。7.JAK-STAT3信号通路相关因子的检测结果:KW-2478作用于HepG2细胞后,western-blot检测结果显示JAK2、p-STAT3和STAT3表达下调,与KW-2478的作用剂量呈现负相关,P<0.05,实验结果具有统计学意义。qPCR实验结果显示STAT3表达下调,与KW-2478的作用剂量呈现负相关,P<0.05,实验结果具有统计学意义。结论:KW-2478对HepG2细胞增殖具有抑制作用,诱导其凋亡和周期阻滞,促进衰老,抑制侵袭。对正常肝细胞HL-7702无抑制作用。影响线粒体凋亡信号通路和周期调控相关因子的表达。可能通过下调STAT3的表达负调控JAK-STAT3信号传导通路。