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研究背景和目的:急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)在重症患者中是常见的临床综合征,影响重症患者的死亡和预后。急性肾损伤联合其他器官功能障碍是导致病人死亡风险增加的重要原因,因肺部毛细血管丰富,细胞因子及炎症分子易集聚于肺部,临床常见急性肾损伤并发急性肺损伤(Acute lung injury,ALI),且死亡率急剧升高。高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)作为一种关键促炎症因子,能够在损伤后的早期被主动分泌或被动释放至细胞外,启动全身炎症反应,介导多种器官的炎症损伤。HMGB1与肾、肺损伤具有密切关系。拮抗HMGB1可减轻缺血再灌注大鼠肾损伤的程度并降低大鼠的死亡率。HMGB1信号的活化亦会影响ALI等呼吸系统疾病的发展,在金黄色葡萄球菌所致小鼠肺损模型中,注射抗HMGB1抗体或其特异受体晚期糖基化终产物受体(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)基因敲除均可减轻小鼠肺损伤程度。但是HMBG1与肾缺血再灌注致新生期大鼠急性肺损伤的关系及其作用目前尚未有明确报道。本课题拟研究HMGB1结合其特异受体RAGE在肾缺血再灌注诱导新生期大鼠急性肺损伤中的作用,为临床干预AKI合并ALI的新生儿患者,提供理论依据及可能的治疗靶点。研究方法:1.建立肾缺血再灌注新生大鼠模型:将日龄10天的SD(Sprague-Dawley)新生大鼠作为实验对象,称取并记录大鼠的体重。大鼠可随机分为正常组(Control组)、缺血再灌注组(IR组)和假手术组(Sham组),IR组大鼠依据再灌注的时间再分为5个亚组,即IR-3h组、IR-6h组、IR-12h组、IR-24h组、IR-48h组。Sham组依据假手术后时间分为Sham-12h组、Sham-24h组两组。我们用结扎大鼠双侧肾蒂45min后恢复新生大鼠肾脏灌注的方法建立新生大鼠缺血再灌注肾损伤模型,用仅游离大鼠双侧肾蒂,但不结扎大鼠肾蒂建立假手术组模型。2.通过HE染色检测肾脏、肺脏组织病理学变化,进行组织损伤评分;血生化检测血肌酐(Scr)浓度,评价肾功能;ELISA法检测肾脏、肺脏组织髓过氧化物酶(MPO)浓度,确定组织的炎症程度;收集大鼠肺泡灌洗液,检测灌洗液蛋白含量并进行细胞涂片,镜下观察细胞数目并将涂片进行Giemsa染色,计算中性粒细胞百分比评估肺泡中性粒细胞浸润程度。3.ELISA检测各组新生大鼠血浆、肾脏和肺脏组织HMGB1表达量,比较各组大鼠血浆、肾脏和肺脏中HMGB1蛋白浓度差异。分离肾组织细胞质和细胞核蛋白,Western blot检测肾组织细胞质及细胞核HMGB1蛋白、肾组织基质金属蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2),及肺组织 HMGB1、RAGE、细胞核因子-kappa B(Nuclear factor kappa B,NF-κB,P65)、磷酸化 NF-κB(Phosphorylated Nuclear factor kappa B,P-NF-κB,P-P65)、TIMP-2等蛋白分子表达量。研究结果1.急性肾损伤大鼠模型成功建立IR组大鼠再灌注12h,Scr水平明显升高,于再灌注24h时,达到峰值。HE染色切片可见IR-24h组肾、肺组织有明显病理损伤,大鼠肾、肺损伤病理评分显著高于 Control 组。2.肾脏、肺脏组织MPO浓度比较IR-3h组大鼠肾、肺组织MPO浓度较Control组显著升高(P<0.05),IR-24h组大鼠MPO浓度达到最大值3.各组大鼠肺泡灌洗液成分比较与Control组比较,IR-24h组大鼠的肺泡灌洗液总蛋白浓度及肺通透指数明显升高。IR-24h组大鼠肺泡灌洗液细胞总数目及Giemsa染色涂片中性粒细胞百分比明显高于 Control 组(P<0.05)。4.ELISA 结果与Control组大鼠比较,IR组大鼠自缺血再灌注3h开始肾脏、血浆中HMGB1浓度均显著升高(P<0.05);肺脏HMGB1浓度自缺血再灌注3h开始升高,于再灌注6h时升高有统计学差异。5.Western Blot 结果IR-24h组大鼠肾脏细胞质HMGB1浓度较Control组显著升高(P<0.001),且IR-24h组大鼠肾脏细胞质HMGB1/细胞核HMGB1比值较Control组均显著升高(P<0.001);IR 组大鼠再灌注 24h 大鼠肺脏中 HMGB1、RAGE、NF-κB、P-NF-κB、TIMP-2表达较正常组均显著增加(P<0.05)。结论1.肾缺血再灌注可以诱导新生大鼠远端肺组织的急性损伤。2.HMGB1的表达改变在肾缺血再灌注诱导新生大鼠急性肺损伤中起重要作用3.HMGB1可能通过结合在肺组织中高表达的特异受体RAGE调控肾缺血再灌注新生大鼠的急性肺损伤。