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葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上种植最广泛的水果之一，全球种植面积740万公顷，产量7780万吨。中国葡萄以每年1170万吨的产量位居世界第一，生产面积(875，000公顷)排名第二。葡萄的种植具有多种用途，包括鲜食葡萄、果汁、葡萄干和生产葡萄酒。近年来，无籽葡萄需求的迅速增长，推动了无籽葡萄品种的发展。在此之前，大量的研究集中在无籽葡萄种子败育的潜在机制。然而，关于调控种子败育关键基因的研究还尚未确定。本研究结合葡萄基因组数据，鉴定获得了葡萄B3和GASA基因家族成员，并进行了系统的生物信息学分析，筛选出葡萄无籽差异表达基因VvABI3-3(VvFUS3)，对其进行了功能鉴定。主要研究结果如下:
1.在葡萄基因组中共鉴定到B3家族基因成员50个，从染色体位置、系统发育进化关系、内含子-外显子分布和启动子顺式作用元件等方面对这些基因进行了基本分析。将这些基因分为5个亚家族，包括ABI3(Abscisic acid insensitive),VAL/HSI(High-level expression of sugar inducible),RAV(Related to ABI3/VP1),ARF(Auxinresponsefactor和REM(ReproductiveMeristem)。这些亚家族分别含有3、4、7、17和19个基因。同线性关系表明，大约60%的基因是由基因组重复(节段或串联)引起的，这有助于葡萄中B3家族的扩展。葡萄和拟南芥之间总共鉴定出16对同源关系，这表明它们在进化前具有共同的祖先。对启动子顺式作用元件组成的分析表明，这些基因大多数可能对激素、光和压力产生反应。生物过程的预测突出了这些基因在转录、果实发育、花器官发育和对脱落酸的响应中的潜在作用。根据B3基因在根、茎、叶、卷须、果实等不同组织中的表达，VvREM14、VvVAL2、VvVAL3、VvRAV7等基因表达比较普遍，可能在生长发育中具有普遍作用。同时还分析了这些基因在红地球和无核白种子发育不同阶段的基因表达。VvRAV3、VvRAV4和VvREM2在无核白中的表达高于红地球，相反VvABI3-1、VvABI33、VvVAL1和VvREM3在红地球中的表达更强烈，表明它们在种子发育或败育中起着重要作用。
2.在葡萄基因组中共鉴定到GASA家族基因成员14个，并进行全面的生物信息学分析和表达分析。在生物信息学分析中，描述了基因在染色体上的位置、蛋白质的理化性质、蛋白质结构和亚细胞定位情况。从结构域、外显子-内含子分布、基序排列、启动子分析、系统发育和进化史等方面对GASA蛋白进行了评价。结果证明，GASA结构域在该家族蛋白质中都是保守的，该蛋白质家族被分为三个亚族，分别命名为G1、G2和G3。综合分析表明，78.5%的GASA基因(14个中的11个)经历了重复(节段和串联)事件。这些结果表明，复制在葡萄中GASA基因家族的扩展中起着至关重要的作用，这可能为GASA基因家族的扩展和功能潜力提供了线索。根据非同义基因(Ka)和同义基因(Ks)之间的比值，复制基因对具有负选择压力。亚细胞定位预测表明大多数蛋白质定位在细胞外区域、叶绿体和液泡中。在启动子分析中，GASA基因可能影响不同的激素信号通路和应激相关机制。除此之外，对GASA基因在植物不同部位的表达进行分析，包括叶片、卷须、茎、花和果实。与生殖器官(花、果实)相比，大多数基因在营养器官(叶、茎和卷须)中高度表达，表明它们在植物生长发育中发挥作用。此外，在红地球和无核白葡萄胚珠发育的不同阶段(花后10、27、34、40和50天)进行基因表达分析比较，在“红地球”和“汤普森无核”种子发育后期，VvGASA2和VvGASA7表达水平不同，说明它们参与了种子发育。
3.与无籽品种相比，VvABI3-3在种子发育后期有较高的表达。根据B3家族分析结果，选择该基因进行功能分析。根据系统发育分析和与同源基因的序列同源性，将VvABI3-3命名为VvFUS3。构建VvFUS3基因过表达载体，将VvFUS3基因cDNA全长编码序列(864 bp)克隆到pCMBIA2300中，将所得载体通过农杆菌介导转化到番茄中。通过基因组PCR证实了阳性转基因株系。不同发育阶段和不同植物部位(叶、花、种子和果实)的表达分析表明，VvFUS3在转基因成熟果实中的表达高于野生型。此外，转基因植株和野生植株在叶片大小、叶片形状和株高方面没有观察到差异。值得注意的是，VvFUS3转基因番茄种子数量和种子重量相比野生型显著降低。除此之外，果实大小、花粉大小、形状和活力并没有受到显著影响。这些数据表明VvFUS3影响了种子正常发育。转基因番茄种子的组织学观察表明，VvFUS3过表达种子在细胞总面积、细胞数和细胞平均横截面积上均有减少。此外，转基因果实果皮的细胞大小增加，但细胞数减少。有趣的是，VvFUS3的转化也影响了番茄自身基因的表达，这些基因在种子发育和激素信号通路中起着潜在作用。这些结果表明，VvFUS3通过影响激素信号通路在种子发育中发挥作用。
综上所述，本研究结果为葡萄B3和GASA基因的功能分析奠定了基础，扩大了我们对葡萄种子发育调控机制的了解，并为进一步深入了解种子败育基因调控机理提供参考。
1.在葡萄基因组中共鉴定到B3家族基因成员50个，从染色体位置、系统发育进化关系、内含子-外显子分布和启动子顺式作用元件等方面对这些基因进行了基本分析。将这些基因分为5个亚家族，包括ABI3(Abscisic acid insensitive),VAL/HSI(High-level expression of sugar inducible),RAV(Related to ABI3/VP1),ARF(Auxinresponsefactor和REM(ReproductiveMeristem)。这些亚家族分别含有3、4、7、17和19个基因。同线性关系表明，大约60%的基因是由基因组重复(节段或串联)引起的，这有助于葡萄中B3家族的扩展。葡萄和拟南芥之间总共鉴定出16对同源关系，这表明它们在进化前具有共同的祖先。对启动子顺式作用元件组成的分析表明，这些基因大多数可能对激素、光和压力产生反应。生物过程的预测突出了这些基因在转录、果实发育、花器官发育和对脱落酸的响应中的潜在作用。根据B3基因在根、茎、叶、卷须、果实等不同组织中的表达，VvREM14、VvVAL2、VvVAL3、VvRAV7等基因表达比较普遍，可能在生长发育中具有普遍作用。同时还分析了这些基因在红地球和无核白种子发育不同阶段的基因表达。VvRAV3、VvRAV4和VvREM2在无核白中的表达高于红地球，相反VvABI3-1、VvABI33、VvVAL1和VvREM3在红地球中的表达更强烈，表明它们在种子发育或败育中起着重要作用。
2.在葡萄基因组中共鉴定到GASA家族基因成员14个，并进行全面的生物信息学分析和表达分析。在生物信息学分析中，描述了基因在染色体上的位置、蛋白质的理化性质、蛋白质结构和亚细胞定位情况。从结构域、外显子-内含子分布、基序排列、启动子分析、系统发育和进化史等方面对GASA蛋白进行了评价。结果证明，GASA结构域在该家族蛋白质中都是保守的，该蛋白质家族被分为三个亚族，分别命名为G1、G2和G3。综合分析表明，78.5%的GASA基因(14个中的11个)经历了重复(节段和串联)事件。这些结果表明，复制在葡萄中GASA基因家族的扩展中起着至关重要的作用，这可能为GASA基因家族的扩展和功能潜力提供了线索。根据非同义基因(Ka)和同义基因(Ks)之间的比值，复制基因对具有负选择压力。亚细胞定位预测表明大多数蛋白质定位在细胞外区域、叶绿体和液泡中。在启动子分析中，GASA基因可能影响不同的激素信号通路和应激相关机制。除此之外，对GASA基因在植物不同部位的表达进行分析，包括叶片、卷须、茎、花和果实。与生殖器官(花、果实)相比，大多数基因在营养器官(叶、茎和卷须)中高度表达，表明它们在植物生长发育中发挥作用。此外，在红地球和无核白葡萄胚珠发育的不同阶段(花后10、27、34、40和50天)进行基因表达分析比较，在“红地球”和“汤普森无核”种子发育后期，VvGASA2和VvGASA7表达水平不同，说明它们参与了种子发育。
3.与无籽品种相比，VvABI3-3在种子发育后期有较高的表达。根据B3家族分析结果，选择该基因进行功能分析。根据系统发育分析和与同源基因的序列同源性，将VvABI3-3命名为VvFUS3。构建VvFUS3基因过表达载体，将VvFUS3基因cDNA全长编码序列(864 bp)克隆到pCMBIA2300中，将所得载体通过农杆菌介导转化到番茄中。通过基因组PCR证实了阳性转基因株系。不同发育阶段和不同植物部位(叶、花、种子和果实)的表达分析表明，VvFUS3在转基因成熟果实中的表达高于野生型。此外，转基因植株和野生植株在叶片大小、叶片形状和株高方面没有观察到差异。值得注意的是，VvFUS3转基因番茄种子数量和种子重量相比野生型显著降低。除此之外，果实大小、花粉大小、形状和活力并没有受到显著影响。这些数据表明VvFUS3影响了种子正常发育。转基因番茄种子的组织学观察表明，VvFUS3过表达种子在细胞总面积、细胞数和细胞平均横截面积上均有减少。此外，转基因果实果皮的细胞大小增加，但细胞数减少。有趣的是，VvFUS3的转化也影响了番茄自身基因的表达，这些基因在种子发育和激素信号通路中起着潜在作用。这些结果表明，VvFUS3通过影响激素信号通路在种子发育中发挥作用。
综上所述，本研究结果为葡萄B3和GASA基因的功能分析奠定了基础，扩大了我们对葡萄种子发育调控机制的了解，并为进一步深入了解种子败育基因调控机理提供参考。