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甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)为菊科属多年生草本植物,其叶片主要用于生产低热量、高甜度的天然甜味剂--甜菊糖苷,其中还含有绿原酸类化合物等活性成分,但由于含量不高,尚未引起科研人员与生产者的关注。本文以甜叶菊叶片为试验材料诱导毛状根,从中筛选优良单克隆根系,建立甜叶菊毛状根培养生产绿原酸类化合物技术体系,在此基础上,进行了扩大培养研究,旨在为甜叶菊毛状根工业化生产绿原酸类物质提供依据。主要结果和结论如下:1.以R1601、ACCC10060、A4和ATCC15834,四种发根农杆菌诱导甜叶菊毛状根,除了ATCC15834外的3种发根农杆菌均成功地诱导出了毛状根,所诱导的根均表现出了多分枝、无向地性、生长迅速等特征。PCR检测,结果表明3种发根农杆菌Ri质粒中rolB和rolC基因均已成功整合到甜叶菊毛状根基因组中。三种发根农杆菌中R1601的诱导能力最强,在该菌诱导下,叶片外植体7 d后开始长出白色突起,2周后从叶片伤口处诱导出白色毛状根,其诱导率为35.7%。2.对三种发根农杆菌所诱导的30个甜叶菊毛状根单克隆根系进行了筛选,其中R1601所诱导的10个单克隆根系中,以R2的绿原酸类物质含量最高,达到4.12%;ACCC10060所诱导的10个单克隆根系中,以A7的绿原酸类物质含量最高,达到3.38%;A4所诱导的10个单克隆根系中,以T1的绿原酸类物质含量最高,达到3.64%进一步对比三种农杆菌所诱导的代表性单克隆根系的绿原酸类物质含量,发现R1601所诱导的R2根系中绿原酸类化合物含量最高,可达到4.12%。因此,选择R2根系进行后续扩大培养试验。3.研究了“摇摆振荡”、“通气加搅拌”、“鼓泡”三种毛状根培养方式,结果表明,鼓泡培养方式比较适应于甜叶菊毛状根扩大培养,培养28 d后,生物量和绿原酸类化合物产量分别达到2.41 g/L,24.58 mg/L。4.研究了毛状根扩大培养生产绿原酸类化合物的关键技术参数,结果表明,“圆柱形”培养器比较适合甜叶菊毛状根培养,在“罐底圆环形分散式”通气、通气管口直径为7 mm、通气量为30~50 m L/min的条件下,毛状根生长速度较快,培养28 d后毛状根生物量和绿原酸类化合物产量分别达到2.21 g/L,40.44 mg/L。5.进行了10 L甜叶菊毛状根鼓泡式培养工艺试验,在优化培养条件下,其生物量和绿原酸类化合物产量分别达到4.72 g/L,159.07 mg/L。6.研究了10 L甜叶菊毛状根鼓泡式培养的营养物质消耗规律,发现毛状根生长状态与培养液中蔗糖、铵态氮、硝态氮和磷酸根离子的消耗速率存在密切关系。试验结果显示,毛状根从适应期到生长期阶段(0-21 d),培养基中的碳源、氮源和磷酸根离子消耗速度比较快;而铁离子在培养前期阶段的消耗速度较快,7 d后其消耗速度显著降低,铁离子浓度缓慢下降。培养基pH值和溶氧总体上呈现出先下降后上升趋势。试验结果表明,毛状根培养到21 d左右消耗了培养基中大部分营养物质。因此,本文后续进行了补料培养研究7.根据毛状根鼓泡式培养营养物质消耗规律,进行了补料培养研究。在装液量为5 L的鼓泡式培养器中,毛状根培养至21 d时,补加1/2初始培养液体积,毛状根的生长周期可延长4周左右,其生物量达到4.77 g/L,绿原酸类化合物产量达到189.84mg/L。综上所述,本文通过筛选获得了优良的甜叶菊毛状根单克隆根系,大幅提高了其绿原酸类化合物含量,建立并优化了10 L鼓泡式毛状根扩大培养生产绿原酸类化合物工艺,并通过补料培养方式进一步提高了目标物的产量。