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研究背景：促甲状腺激素(TSH)是腺垂体合成和分泌的激素,它通过与促甲状腺激素受体(TSHR)结合发挥功能。研究发现TSHR主要存在于甲状腺滤泡细胞膜,在大脑、淋巴细胞、脂肪组织、骨骼和纤维母细胞等多种甲状腺外组织细胞也有表达,广泛参与甲状腺外组织器官的功能调节。我们前期研究已证实在肝细胞上有TSHR的表达；并且TSHR是有功能性的。那么,在肝脏中,TSH通过TSHR发挥的作用及其机制需要深入探讨。近年来,越来越多的临床数据表明：TSH升高与血清甘油三酯(TG)水平升高有关,许多研究支持在校正混杂因素,包括甲状腺激素的影响后,即便是TSH在参考值范围内逐渐升高时,血清甘油三酯水平也随之升高。但是两者之间没有明确的研究机制。甘油三酯主要在肝脏中合成,它的代谢受固醇调控元件结合蛋白1c(SREBP-1c)的转录调控。SREBP-1c是SREBPs转录因子家族中的一员；而SREBPs是膜结合转录因子,属于碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链转录因子家族(bHLH Zip)。 SREBPs能够被磷酸化而调节活性,而且AMP激活的蛋白激酶(AMPK)能够磷酸化SREBP-1c丝氨酸(Ser)372位点,抑制SREBP-1c的入核,对肝脏甘油三酯的合成起着重要作用。AMPK被称为细胞能量传感器,乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是其下游底物,且ACC是脂肪酸合成关键酶,在控制肝脏甘油三酯代谢中起重要作用。AMPKa亚基有多个磷酸化位点,苏氨酸(Thr)172是其主要活性位点,为其活化所必须。脂肪细胞AMPKα Ser173被磷酸化后,阻断AMPKα激活所必须的Thr172磷酸化,继而影响AMPK活化后的作用。但TSH是否影响肝脏AMPKα Ser173,以及TSH激活AMPK的作用机制及激活后对脂质合成的作用未见报道。我们前期研究表明,TSH结合肝脏上的TSHR,通过cAMP/PKA/CREB调节肝脏胆固醇合成。在本课题中,我们将要探索TSH结合TSHR后,是否通过PKA/AMPK介导的SREBP-1c磷酸化,调节肝脏甘油三酯的合成。这将为高甘油三酯血症、肥胖和代谢综合征等的临床治疗提供新思路和药物作用靶点。目的：临床研究发现,亚临床甲状腺功能减退患者常伴有血清TG水平升高,但其机制不清。我们流行病学调查发现亚甲减患者血清TSH与TG水平正相关,既往研究证实肝细胞存在功能活性的TSHR。至今国内外未见TSH调节肝脏TG代谢的相关报道。本研究以TSH为研究对象,探讨TSH调节肝脏TG合成的作用及其机制,为认识TSH甲状腺外的调脂效应提供了新视角和新理论。研究方法：1、分别建立野生型(Tshr+/+)和受体敲除(Tshr-/-)小鼠、AMPK激动剂AICAR腹腔注射Tshr+/+和Tshr-/-小鼠及PKA的抑制剂H89注射C57小鼠动物模型,测定肝脏内TG含量、肝脏中调节TG合成相关的关键分子SREBP-1c的磷酸化或核蛋白表达及其下游分子,如ACC1、脂肪酸合酶(FASN)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD1)的转录水平的变化。2、用TSH刺激人肝癌细胞株(HepG2)后,测定细胞内TG含量及肝细胞中调节TG合成相关的关键分子SREBP-1c的磷酸化及核蛋白表达及其下游分子ACC1、FASN.SCD1的转录水平的变化。且用Flag标签的SREBP-1c野生型(WT)和S372A突变质粒刺激肝癌细胞后,检测SREBP-1c的下游分子(FASN和SCD1)的转录水平。3、用AMPK激动剂AICAR、AMPK持续激活过表达质粒CA-AMPK或者PKA抑制剂H89分别预处理HepG2细胞,TSH刺激细胞后,观察与TG代谢相关的SREBP-1c及其下游分子表达活性改变,以及继发的肝细胞内TG含量变化。4、主要技术：甘油三酯定量、Real-time PCR、免疫沉淀、免疫荧光、质粒转染及建立小鼠实验模型等。结果：1、受体敲除小鼠(Tshr-/-)的肝脏TG含量为野生型(Tshr+/+)小鼠约25%(P<0.05),脂质合成的相关分子SREBP-1c. ACC1、FASN、和SCD1转录水平升高20-80%(P<0.05)。肝脏SREBP-1c成熟体蛋白表达降低,SREBP-1cSer372磷酸化升高且ACC Ser79、AMPK Thr172非Ser173磷酸化增加；AMPK转录水平没有统计学差异。腹腔注射AICAR和溶媒处理Tshr+/+和Tshr-/-小鼠2周后,SREBP-1c磷酸化及其下游分子mRNA水平及TG含量出现相应的变化。C57小鼠腹腔注射H89后,SREBP-1c的入核表达降低。体内实验验证TSH依赖于TSHR在肝脏TG合成中发挥的效应。2、TSH刺激HepG2细胞后,TG含量较对照组增加约30%(P<0.05)；免疫荧光显示TSH明显促进SREBP-1c在胞核内的表达；Western blotting结果显示SREBP-1c Ser372的磷酸化表达减少；SREBP-1c直接调控的下游分子ACC1、FASN、和SCD1转录水平升高近2倍(P<0.05)。用SREBP-1c野生型(WT)和S372A突变质粒刺激肝癌细胞后,S372A突变质粒引起的SREBP-1c的下游分子的转录水平较WT质粒升高更明显,提示S372A突变体对于脂质相关基因的转录水平起着重要作用。这些结果提示TSH通过影响SREBP-1c的表达而促进肝脏甘油三酯合成。3、TSH刺激HepG2细胞后,AMPK磷酸化位点Thr172表达降低,活性降低,但AMPK Ser173表达水平无统计学差异；当用AICAR或CA-AMPK预处理细胞刺激AMPK活性,TSH诱发的SREBP-1c磷酸化及TG含量水平出现相反的变化。当用H89预处理细胞抑制PKA活性,TSH诱发的AMPK的抑制出现相反的变化。说明AMPK在TSH调节SREBP-1c磷酸化及TG含量中起着不可或缺的作用。结论：1、TSH增加肝脏甘油三酯聚积。2、SREBP-1c磷酸化在TSH调控肝脏TG聚集过程中起重要作用。3、AMPK参与TSH调控肝脏SREBP-1c磷酸化及TG含量过程,并发挥重要作用。