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化疗在肺癌的综合治疗中具有重要地位，但导致疗效欠佳的一个重要原因是多药耐药(multidrug resistance，MDR)的形成。为研究化疗所诱导的肺癌细胞产生MDR的机制，本课题以人肺癌细胞系NCI-H446细胞为肺癌模型，分别予以不同浓度的喜树碱和顺铂刺激，先以Annexin V-FITC/PI、罗丹明123和钙黄绿素AM染色流式细胞术检测化疗药诱导肺癌细胞凋亡、线粒体膜电位变化及细胞活力;次以免疫印迹法检测多药耐药蛋白ABCG2、MRP2和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达变化情况;继以核质分离结合免疫印迹法和免疫荧光激光共聚焦技术检测化疗药对耐药相关细胞信号通路ATM、NF-κB的激活情况;最后结合ATM和NF-κB通路抑制剂CGK733和BAY11-708阻遏相关激酶活性，以免疫印迹法探究喜树碱和顺铂上调多药耐药蛋白ABCG2、MRP2和抗凋亡蛋白Bcl-2的分子机制。
结果发现:首先，低剂量喜树碱和顺铂(0.5μg/ml)在不引起肺癌细胞NCI-H446明显凋亡的前提下，可明显改变NCI-H446细胞线粒体膜电位并上调多药耐药蛋白ABCG2、MRP2和抗凋亡蛋白Bcl-2表达;其次，低剂量喜树碱和顺铂可有效激活ATM信号通路，并上调细胞质内p65和IκBα的磷酸化水平进而促进p65的核转位;再次，ATM磷酸化激酶抑制剂CGK733能有效抑制喜树碱诱导的细胞质内p65和IκBα的磷酸化水平及细胞核内p65的表达;最后，ATM和NF-κB信号通路抑制剂CGK733和BAY11-708均能有效抑制由喜树碱所诱导的ABCG2、MRP2和Bcl-2上调。上述结果提示，喜树碱和顺铂可通过激活肺癌细胞NCI-H446中ATM/NF-κB信号通路上调多药耐药蛋白ABCG2、MRP2等来启动MDR机制以保护自身免遭化疗药物的杀伤，ATM将可能成为阻止喜树碱和顺铂所诱导的肺癌多药耐药形成的潜在靶点。
急性损伤可导致机体产生免疫应激而引起促炎介质大量释放并威胁重要脏器的功能，糖皮质激素等免疫抑制剂通过抑制过强的免疫应激而成为SARS等疾病早期治疗的利器。“胆碱能抗炎通路”是新近发现的神经-免疫调节通路，对预防和拮抗过度的炎症反应具有重要作用。尼古丁，作为一种胆碱能受体激动剂，可有效抑制免疫过激所致的促炎因子的释放。但迄今为止，尼古丁抗炎通路的分子机制尚不清楚。TIPE2是最近发现的一种免疫负调节分子，属于TNFAIP8家族，对于维持体内免疫平衡具重要作用。Stat3是炎症反应的负调控因子，在细胞因子信号传递中起着主导作用，但TIPE2与Stat3在尼古丁介导的抗炎通路中的可能作用及机制有待深入研究。
本课题首先以Western blot检测尼古丁对Erk1/2、PI3K/Akt和Jak2/Stat3信号通路的激活情况;其次，先以相关信号激酶抑制剂阻遏激酶活性，再给予尼古丁刺激，以Western blot探讨尼古丁调控TIPE2表达的分子机制;再次，分别以Western blot、流式细胞术胞内染色检测TIPE2过表达对LPS所致的NF-κB通路激活及炎症因子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α释放的影响;接着，以Stat3激酶抑制剂AG490阻遏其激酶活性，再给予尼古丁刺激，以免疫印迹法和免疫荧光激光共聚焦技术探究Stat3在尼古丁调控NF-κB活性中的作用;最后，以免疫共沉淀法检测尼古丁刺激对Stat3与NF-κB p65的结合情况，从而初步阐明尼古丁通过NF-κB通路调控炎症反应的机制。
结果发现:首先，1μM尼古丁刺激Raw264.7细胞5 min后可激活Jak2、Erk1/2和PI3K/Akt通路，3hrs后可激活Stat3通路;其次，Erk1/2抑制剂U0126、Mek抑制剂PD98059、PI3K抑制剂Wortmannin和Akt抑制剂LY294002均能明显抑制尼古丁对TIPE2的上调作用，其中U0126、PD98059、LY294002抑制作用最为明显;再次，LPS刺激后15、30 min，TIPE2过表达可使IKKα/β的磷酸化水平明显低于空载细胞;第四，TIPE2过表达可抑制LPS所致的IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的释放，其抑制率分别为12.5％、12.5％、25％、12.5％和14.3％;第五，在LPS刺激的条件下，尼古丁预处理可明显增加胞质中的p65，而以AG490阻遏Stat3磷酸化可降低尼古丁所上调的胞质中p65;细胞核p65检测结果则与细胞质结果呈负相关;最后，免疫共沉淀结果显示，尼古丁预处理增强p65与p-Stat3的结合。
通过以上研究，我们发现尼古丁可通过上调TIPE2表达和Stat3磷酸化而对促炎因子所致的NF-κB通路活化发挥负调控作用，进而减少炎症因子的释放。本课题揭示了TIPE2与Stat3在尼古丁抗炎通路中的作用及机制，为进一步探讨神经系统与免疫系统之间的联系、采取新的抗炎策略和干预手段提供理论依据。