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非整倍体严重危害人类生殖健康,是导致不育不孕及先天性出生缺陷的重要原因。减数分裂过程中,同源染色体不能正常配对联会和遗传重组异常都会导致配子发生异常,如非整倍体精子的产生。本文利用免疫荧光染色对人精母细胞联会复合体(SCs)上的重组位点进行研究,主要内容为以下三个部分:
1.为保存接受睾丸活检术及可能造成生殖损伤治疗的患者的生殖能力,睾丸组织的深低温冷藏变得尤为必要。本文利用联会复合体蛋白SCP3、重组修复蛋白MLH1和着丝粒蛋白的免疫荧光染色,对5例正常人新鲜和冷冻后的睾丸组织进行了减数分裂进程、联会、重组以及联会复合体结构的研究。结果显示:和新鲜组织比较,冷冻组织的减数分裂进程、细胞中MLH1位点的平均数以及不同MLH1位点的SC平均数都没有明显差异,证明了深低温冷藏对于睾丸组织的减数分裂没有影响。
2.染色体易位携带者的精子发生过程通常会停滞,造成不育。本文对一例1号和21号染色体相互易位的无精症病人的睾丸活检组织进行了SCP3、MLH1、着丝粒蛋白,以及转录激活调控蛋白γH2AX/BRCA1的免疫荧光染色。结果表明:与正常人睾丸组织相比较,t(1;21)患者精母细胞中有gap的SCs显著增加,性染色体(XY)上遗传重组显著减少。96%的粗线期细胞中易位染色体联会形成四价体,其中不完全联会的区域经常和性染色体相连(84%)。此外,γH2AX和BRCA1定位在易位染色体不联会的区域,表明此区域内基因发生了转录沉默。这些减数分裂异常可能造成染色体易位病人的不育。
3.现在用于不育病人减数分裂遗传重组分析的方法费时费力,而且需要大量睾丸组织。因此,建立了一种新的适用于微量样本分析的联会复合体制备方法.细胞离心甩片法。利用细胞离心甩片法,从小鼠、大鼠、牛和人的睾丸组织以及小鼠卵巢组织中成功制备了联合复合体,并与铺展法制备的标本比较,发现小鼠睾丸组织SC的相对和绝对长度、细胞中MLH1平均数和具有0-2个MLH1的SC的平均数没有显著差异。结果表明,离心甩片法是一种简便、快速、节省实验材料、且适用于不同动物减数分裂SC研究的方法。