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甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)作为人体天然免疫系统中重要的模式识别受体,近年来一直是天然免疫研究的热点之一。MBL是由肝细胞分泌的胶原样复合血浆蛋白,为C型凝集素家族成员。成熟的MBL肽链自N端至C端依次为富含半胱氨酸(Cys)的N末端区、胶原样区(collagen-like region, CLR)、α螺旋构成的颈区和C端的糖识别域(carbohydrate recognition domain, CRD)[2]。 MBL在机体天然免疫中有重要的抗感染作用,它利用CRD识别广泛分布于多种病原体如细菌、真菌、病毒和寄生虫等表面的糖蛋白或糖结构,例如D-甘露聚糖、盐藻糖、N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰葡萄糖胺等。其CLR与甘露聚糖相关丝氨酸蛋白酶(mannan-binding lectin associated serine protease, MASP1、MASP2、MASP3)结合形成MBL-MASPs复合物,激活补体介导的凝集素途径而发挥调理功能；或者与吞噬细胞胶凝素受体(ClqR)结合,以不依赖于补体的方式启动调理吞噬。此外,球形结构的CRD与某些病毒(如流感病毒A)结合后可直接中和病毒活性。血浆中的MBL是二至六聚体的混合物,只有三聚体及以上的高聚体MBL才能有效识别病原体表面的糖结构,进而激活补体。MBL在人血清中的含量很低,正常人平均含量为1mg/L。MBL亦是一种急性期反应蛋白,在应激状态下(如外科手术、病原体感染、肿瘤等),其血浆浓度可升高2-3倍。MBL缺损患者处于高度的感染风险之中,表现为多种病原体的反复急慢性感染,然而MBL水平过高,可能会通过凝集素途径而过度活化补体,导致机体的炎症性损伤。有文献报道,高MBL水平与缺血-再灌注损伤的炎症反应、糖尿病肾脏并发症及原发性胆汁性淤积型肝硬化有关。相反,MBL水平低下,其激活补体的能力相对下降,则降低了炎症介质对宿主细胞的损伤。此外,高水平MBL可能会促进吞噬细胞(如单核巨噬细胞、中性粒细胞等)对胞内寄生菌的摄取,如结核分枝杆菌和利什曼原虫等,增加了病原体入侵的机会,因此正常水平的MBL对机体尤为重要。众所周知,单核巨噬细胞在天然免疫应答中发挥重要作用,并参与特异性免疫应答。正常情况下单核巨噬细胞通过吞噬异物、细菌、衰老和突变的细胞以及天然的免疫复合物维持机体的免疫稳态。据文献报道,富含MBL的人血清能促进吞噬细胞的调理吞噬功能。鉴于上述MBL的重要作用和商品化抗MBL抗体的昂贵价格,本科室制备了一系列抗MBL单克隆抗体,并从中筛选了一株功能性单抗1C8。有研究表明,MBL能增强补体的活化和促进吞噬细胞吞噬病原体,但是抗MBL单抗对单核巨噬细胞调理吞噬的作用目前尚未见报道,故本课题组以单核巨噬细胞为切入点,初步探索1C8对单核巨噬细胞调理吞噬功能的影响及其作用机制。我们首先鉴定了抗MBL抗体1C8的纯度和生物学活性,它能与本科室提取的天然有活性的MBL和商品MBL以剂量依赖的形式结合,并初步探讨了1C8对混合人血清刺激的单核巨噬细胞调理吞噬功能的影响及其作用机制。第一章抗MBL单克隆抗体1C8的纯化和鉴定随着对MBL研究的不断深入,发现其除了能识别并清除病原体之外,还有许多内源性功能(endogenous function),例如识别缺血-再灌注损伤中暴露的自身抗原、参与吞噬凋亡细胞、结合肿瘤细胞并发挥MBL介导的细胞毒作用等,但是抗MBL抗体有关的报道甚少。目前市场上已经有商品的抗MBL单克隆抗体,但是因为其价格昂贵,令人望而却步,而且其针对的是真核表达的商品MBL,而不是天然纯化的MBL。本课题组多年以来一直致力于天然MBL的纯化和相关功能的研究,尤其是纯化分离MBL的技术已经成熟。鉴于此,本科室制备了以天然纯化的MBL为抗原的单克隆抗体(1C8等)。本部分工作主要是鉴定1C8的纯度和生物学活性。首先复苏本科室已经制备并保存在液氮的杂交瘤细胞株1C8,然后制备单克隆抗体腹水,经辛酸-硫酸铵沉淀法(CA-AS)纯化腹水中的单克隆抗体,进一步我们分别运用SDS-PAGE和Western-blot鉴定了1C8的纯度与特异性,并通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbence assay, ELISA)同商品化的抗MBL抗体HYB131-11做了比较,检测了1C8的敏感性。根据检测结果分析,1C8不仅能与本科室自提天然有活性的MBL结合良好,亦能与商品MBL结合,而且同商品化的抗MBL抗体HYB131-11没有显著区别。以上结果表明1C8有良好的结合MBL的生物学活性,为1C8的应用提供了实验依据。第二章1C8对人单核巨噬细胞调理吞噬功能的影响有研究表明,富含MBL的人血清能促进吞噬细胞的调理吞噬和增强补体的活化,但是凝集素途径过强则会导致炎症性损伤。单核巨噬细胞作为专职的抗原递呈细胞,它通过吞噬衰老的细胞和病原体等维持机体的稳态。本部分工作主要是分离和培养人单核巨噬细胞,旨在探讨1C8对含MBL的混合人血清诱导的单核巨噬细胞调理吞噬功能的影响。无菌分离人外周血单个核细胞(peripheral blood monoeuclear cell, PBMC),用流式细胞术(flow cytometry, FCM)分析时,将1C8/IgG、10%灭活/未灭活混合人血清和FITC-白色念珠菌预先孵育30min后加入到PBMC中,37℃摇床孵育30min,然后检测1C8对CD14+的单核细胞吞噬FITC-白色念珠菌的影响。在用荧光显微镜观察1C8对巨噬细胞吞噬功能的影响时,预先将PBMC贴壁2h,待贴壁细胞形态良好时加入50ng/ml的M-CSF,培养9d。FCM结果显示,1C8能抑制混合人血清诱导的单核细胞吞噬FITC-白色念珠菌,而且能降低到无补体的灭活血清水平。在荧光显微镜下观察1C8对巨噬细胞吞噬FITC-白色念珠菌的影响与FCM的结果一致,表现为1C8组的巨噬细胞吞噬FITC-白色念珠菌的数目减少。以上结果为1C8直接调节MBL介导的凝集素途径提供了实验依据。尚需要进一步解决的问题是：1C8与MBL结合的结构域的初步确定；1C8对其他免疫细胞的调节作用等。第三章1C8对人单核巨噬细胞调节作用的机制初探为了初步探讨1C8对单核巨噬细胞调节功能的作用机制,首先我们重组表达了人MBL-CRD蛋白(recombinant human MBL-CRD, rhMBL-CRD),并对其进行了SDS-PAGE和Western-blot鉴定。采用ELISA研究1C8与rhMBL-CRD、 MASP-1C、MASP-2C和MASP-2N蛋白的结合,并用SDS-PAGE和Western-blot鉴定1C8与rhMBL-CRD、rhMBL-CLR结合的特异性。用直接ELISA分析甘露聚糖(mannan)、甘露糖(mannose)、D-半乳糖、D-半乳糖胺、D-甘露糖胺和D-葡萄糖胺对HRP-1C8结合rhMBL-CRD的影响。并用凝集实验观察1C8对rhMBL-CRD结合FITC-大肠杆菌及FITC-白色念珠菌的影响。rhMBL-CRD的Western-blot结果提示,rhMBL-CRD能与本科室制备的抗MBL-CRD单克隆抗体结合良好,在43KD处有明显条带。ELISA结果显示1C8能以剂量依赖的方式结合rhMBL-CRD,但不与MASP-1C、MASP-2C和MASP-2N蛋白结合,同Western-blot的结果一致。直接ELISA的结果表明,1C8与rhMBL-CRD的结合能被上述六种糖所阻断,随着糖浓度的降低,1C8与rhMBL-CRD的结合增强。在荧光显微镜下观察FITC-大肠杆菌及FITC-白色念珠菌的凝集,发现1C8能阻断FITC-大肠杆菌及FITC-白色念珠菌与rhMBL-CRD的结合,而作为1C8对照的IgG组则没有区别。以上结果提示1C8通过CRD结合MBL,并通过与病原体表面的糖结构竞争结合CRD而阻断MBL介导的凝集素途径。综上,本研究发现,抗MBL单克隆抗体1C8可与本科室自提天然有活性的MBL及商品MBL结合,而且与商品化的抗MBL抗体HYB131-11没有区别。通过检测1C8对混合人血清刺激的单核巨噬细胞调理吞噬功能的影响及1C8与MBL结合部位的确定,初步获得了1C8应用价值的证据。但是1C8对MBL诱导的单核巨噬细胞增殖和分泌细胞因子的调节作用,以及对其它免疫细胞的影响均需要进一步的研究。下一步工作将继续探索1C8对单核巨噬细胞分泌炎性细胞因子和凋亡的影响,并进一步研究1C8对T细胞、NK细胞等的调节作用。本研究将为1C8的后续应用提供实验依据,并为高水平MBL有关疾病的防治研究提供新的理论依据和靶点。