论文部分内容阅读
灰霉病(Botrytis cinerea)是葡萄采后病害中最具毁灭性的病害之一。长期以来,SO2熏蒸等被认为是最有效的防治措施。随着人们对于农药残留、环境污染以及人类健康等方面的不断关注,迫切需要新型高效、环保、无毒的生物保鲜剂来取而代之。
本研究旨在分离、筛选能有效抑制葡萄采后灰霉病的生防酵母菌株,建立该菌株的作用模式,并通过添加外源物质进一步提高其生防能力。通过对该酵母菌株作用机理进行研究,建立包括营养空间竞争、寄生、诱导抗性及产生抑菌物质等在内的综合抑菌机理模式。主要结果如下:
1.从葡萄果实及果实伤口处共分离到酵母菌株248株。通过离体筛选得到10个菌株对灰霉病有明显的拮抗作用。其中,浓度为1.0×108个/mL的菌株P-2对1.0×105spore/mL灰霉菌的抑菌圈可达到23.08 mm。进一步活体筛选得到可显著抑制葡萄灰霉病的生防菌P-2。果实接种处理6 d后,1.0×108个/mL菌株P-2可完全抑制果实发病。
葡萄果实贮藏实验结果:贮藏50 d后,生防菌P-2处理后果实的发病率为15％,与多菌灵处理后的果实发病率(14％)无显著差异。此外,生防菌P-2可在一定程度上降低葡萄贮期内的果实脱粒率。贮藏50 d后,生防菌P-2处理后的葡萄果实脱粒率为28％,与对照处理(40％)差异显著。
生防菌P-2处理对葡萄果实的可溶性固形物含量、可滴定酸和Vc含量无显著影响,不影响果实品质。
2.生防菌P-2对于葡萄采后灰霉菌的最佳作用模式:与培养原液、无菌滤液相比,菌株P-2细胞悬浮液对于灰霉菌的生防效果最佳,抑病率可达到90％。菌株P-2供试浓度为1.0×108个/mL时生防效力最佳,可以完全抑制1.0×104 spores/mL、1.0×105 spores/mL和1.0×106 spores/mL灰霉菌生长；先接种菌株P-2后接种灰霉菌处理的生防效力最佳,与生防菌和病原菌同时接种相比,接种菌株P-2后2 h,24 h和48 h再接种灰霉菌的果实发病率明显降低。
3.拮抗酵母菌鉴定:经形态学、生理生化指标及rDNA-ITS序列分析对菌株P-2进行了鉴定。结果表明:菌株P-2为汉逊酵母属(Hanseniaspora)葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)。
4.通过对H.uvarum P-2拮抗机理进行初步探讨,发现其可能存在的作用机理如下:
(1)显著抑制灰霉菌孢子萌发和菌丝生长。生防菌P-2对于灰霉孢子萌发及菌丝生长的抑制率分别达到88％和70％。
(2)可在葡萄果实伤口处迅速定殖生长,与灰霉菌间形成强有力的竞争作用。在灰霉菌存在或者不存在的情况下,生防菌P-2均可在果实伤口处迅速定殖和生长。营养空间竞争可能是生防菌P-2的抑菌机理之一。
(3)在常温贮藏条件下,生防菌P-2处理能够显著提高果实过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸裂解酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及β-1,3-葡聚糖酶等抗病性相关酶活性,因此推测诱导抗性可能是H.uvarum P-2的抑菌机理之一。
(4)通过显微镜观察,可发现生防菌P-2能紧密吸附在灰霉菌菌丝体上,推测菌株P-2与灰霉菌之间可能存在寄生关系。
(5)从菌株P-2无菌发酵液中分离到抑菌物质粗提物。其生理生化性质研究结果表明:粗提物对葡萄、芒果和柑橘主要采后病害表现强抑制作用；经121℃高温高压处理20 min、蛋白酶K、胰蛋白酶处理,均不能破坏其抑菌活性；且该粗提物呈酸性。
优化该抑菌物质粗提物发酵条件,结果表明:在自然pH值条件下,接种量为1％,摇瓶装液量为50 ml/250 ml,培养36 h～48 h时,抑菌物质产量较大。
5.生防菌P-2生防效力改良实验结果表明:钼酸铵(NH4-Mo)、硅酸钠(Na2SiO3)、碳酸氢钠(NaHCO3)和茶多酚(tea polyphenol)等物质均在一定浓度下显著提高生防菌P-2抑菌能力。氯化钙(CaCl2)不能显著提高其抑菌能力。
此外,对菌株P-2的最适发酵条件进行研究,其最适发酵条件为:培养基为YPD,培养温度为20℃,培养时间为96 h,初始pH值为6.0,摇瓶装量为100 ml/250 ml。