论文部分内容阅读
目的：探讨柚皮素(NAR)对高糖刺激巨噬细胞极化状态的影响及其相关机制的研究。
方法：用二甲基亚砜（DMSO）溶解NAR配制成母液，取小鼠巨噬细胞Raw264.7对数生长期用于预实验，采用CCK-8法用于检测柚皮素对细胞增殖活力的影响，设置培养液葡萄糖浓度梯度为1g/L、2g/L、4g/L、5g/L、6g/L，配制不同葡萄糖浓度的DMEM培养基，并按糖浓度做好标记（a,b,c,d,e）；细胞在培养箱中培养24h。一氧化氮合酶（NOS）分型测试盒检测细胞内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性，根据活性-浓度曲线筛选出低糖和高糖培养液的糖浓度。实验分组情况如下：对照组：正常对照（NG）、渗透压对照（NG+M）、高糖对照（HG）；药物处理组：高糖+柚皮素（HG+NAR）、高糖+法舒地尔（HG+F）、高糖+C3转移酶（HG+C3），其中药物干预组设置法舒地尔、C3转移酶为RhoA/ROCK通路的阻断剂作为阳性对照。各组小鼠巨噬细胞Raw264.7根据分组情况进行干预后继续培养24h,收集上清液做ELISA检测；检测指标分别为：白介素10（IL-10）、白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。细胞裂解后提取蛋白做免疫蛋白印迹（Western blot）检测。选取β-Actin为内参跑出电泳条带，分别为以下蛋白分子：RhoA/ROCK通路相关蛋白（RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1）、iNOS、精蛋白-1(Arg-1)。本实验为探讨Raw264.7表型情况，选用CD80、iNOS抗体标记M1，Arg-1、CD206抗体标记M2，用流式细胞仪分选Raw264.7，检测各组小鼠巨噬细胞M1和M2的数量及其比例（M1/M2）。
结果：与NG组相比，本次实验所测指标NG+M组结果基本一致，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明溶液的渗透压对本实验结果不产生影响，其余各组与正常对照组结果不同，具有统计学意义，可进行后续统计学分析。与NG组比较，高糖刺激Raw264.7激活RhoA/ROCK通路，与之相关的蛋白分子（RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1）、促炎介质iNOS蛋白均表达增加，抑炎介质Arg-1蛋白表达下降(P＜0.05)；炎症细胞因子白介素-6、TNF-α分泌增加，抗炎因子白介素-10分泌减少(P＜0.05)；流式结果显示M1型巨噬细胞的数量增加，M1/M2比值升高(P＜0.05)。与HG组比较，三种药物处理后均显示抑制RhoA/ROCK通路蛋白分子、iNOS蛋白表达及IL-6、TNF-α炎症因子的分泌，而Arg-1蛋白表达、IL-10分泌增加(P＜0.05)；药物干预对巨噬细胞表型分化产生与高糖对照组相反的实验结果，结果显示M2型数量增加，M1/M2降低(P＜0.05)。HG+NAR、HG+F、HG+C3实验结果之间两两比较均无统计学差异（P＞0.05），进一步证实本实验结论。
结论：柚皮素可能通过下调RhoA/ROCK信号通路，促进高糖刺激的巨噬细胞向M2型分化。
方法：用二甲基亚砜（DMSO）溶解NAR配制成母液，取小鼠巨噬细胞Raw264.7对数生长期用于预实验，采用CCK-8法用于检测柚皮素对细胞增殖活力的影响，设置培养液葡萄糖浓度梯度为1g/L、2g/L、4g/L、5g/L、6g/L，配制不同葡萄糖浓度的DMEM培养基，并按糖浓度做好标记（a,b,c,d,e）；细胞在培养箱中培养24h。一氧化氮合酶（NOS）分型测试盒检测细胞内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性，根据活性-浓度曲线筛选出低糖和高糖培养液的糖浓度。实验分组情况如下：对照组：正常对照（NG）、渗透压对照（NG+M）、高糖对照（HG）；药物处理组：高糖+柚皮素（HG+NAR）、高糖+法舒地尔（HG+F）、高糖+C3转移酶（HG+C3），其中药物干预组设置法舒地尔、C3转移酶为RhoA/ROCK通路的阻断剂作为阳性对照。各组小鼠巨噬细胞Raw264.7根据分组情况进行干预后继续培养24h,收集上清液做ELISA检测；检测指标分别为：白介素10（IL-10）、白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。细胞裂解后提取蛋白做免疫蛋白印迹（Western blot）检测。选取β-Actin为内参跑出电泳条带，分别为以下蛋白分子：RhoA/ROCK通路相关蛋白（RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1）、iNOS、精蛋白-1(Arg-1)。本实验为探讨Raw264.7表型情况，选用CD80、iNOS抗体标记M1，Arg-1、CD206抗体标记M2，用流式细胞仪分选Raw264.7，检测各组小鼠巨噬细胞M1和M2的数量及其比例（M1/M2）。
结果：与NG组相比，本次实验所测指标NG+M组结果基本一致，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明溶液的渗透压对本实验结果不产生影响，其余各组与正常对照组结果不同，具有统计学意义，可进行后续统计学分析。与NG组比较，高糖刺激Raw264.7激活RhoA/ROCK通路，与之相关的蛋白分子（RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1）、促炎介质iNOS蛋白均表达增加，抑炎介质Arg-1蛋白表达下降(P＜0.05)；炎症细胞因子白介素-6、TNF-α分泌增加，抗炎因子白介素-10分泌减少(P＜0.05)；流式结果显示M1型巨噬细胞的数量增加，M1/M2比值升高(P＜0.05)。与HG组比较，三种药物处理后均显示抑制RhoA/ROCK通路蛋白分子、iNOS蛋白表达及IL-6、TNF-α炎症因子的分泌，而Arg-1蛋白表达、IL-10分泌增加(P＜0.05)；药物干预对巨噬细胞表型分化产生与高糖对照组相反的实验结果，结果显示M2型数量增加，M1/M2降低(P＜0.05)。HG+NAR、HG+F、HG+C3实验结果之间两两比较均无统计学差异（P＞0.05），进一步证实本实验结论。
结论：柚皮素可能通过下调RhoA/ROCK信号通路，促进高糖刺激的巨噬细胞向M2型分化。