【摘 要】
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浮萍棘尾虫作为纤毛虫的模式物种,具有细胞个体较大、接合型数目多以及核的两型性等特点,已经在遗传学、基因组学、发育生物学以及分子生物学等领域被作为单细胞生物模型而广泛研究。本实验室分析了表皮生长因子（EGF）促分裂条件下浮萍棘尾虫分裂增殖96 h、108 h和120 h的转录组数据,发现包含细胞周期蛋白B族及其依赖激酶类似物,该基因家族与细胞周期调控密切相关。细胞周期调控机制始终是生物学研究的重要科
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浮萍棘尾虫作为纤毛虫的模式物种,具有细胞个体较大、接合型数目多以及核的两型性等特点,已经在遗传学、基因组学、发育生物学以及分子生物学等领域被作为单细胞生物模型而广泛研究。本实验室分析了表皮生长因子（EGF）促分裂条件下浮萍棘尾虫分裂增殖96 h、108 h和120 h的转录组数据,发现包含细胞周期蛋白B族及其依赖激酶类似物,该基因家族与细胞周期调控密切相关。细胞周期调控机制始终是生物学研究的重要科学问题之一,本研究以浮萍棘尾虫为实验模型,通过RT-PCR技术克隆获得了3条StyCYCB基因,对基因序列及编码的蛋白进行生物信息学分析,结合qRT-PCR技术定量野生型浮萍棘尾虫3条StyCYCB基因在无性增殖过程中的基因表达模式。构建StyCYCB2基因的靶向RNA干扰表达载体,通过稳定的干扰体系,实现StyCYCB2基因表达沉默的目的,结合基因表达量的变化、荧光蛋白的表达定位以及核行为变化等,分析了StyCYCB2基因在浮萍棘尾虫细胞无性分裂周期中的功能。同时,利用单细胞转录组测序技术分析了其调控浮萍棘尾虫细胞增殖的分子机制。获得如下结果:1.浮萍棘尾虫细胞周期蛋白B家族基因的克隆和序列分析通过RT-PCR扩增得到StyCYCB1、StyCYCB2及StyCYCB3 cDNA序列,编码区长度分别为801 bp、1452 bp和1662 bp。生物信息学分析发现均为主要定位于细胞核的亲水性蛋白,三级结构与二级结构相对应,存在多个保守位点。荧光定量表达分析发现,3条StyCYCB基因在浮萍棘尾虫的营养生殖时期表达具有显著的时间特异性,在分裂间期和分裂期的表达模式有差异。推测其对起始无性生殖过程具有重要作用。StyCYCB2基因序列的第806-1132位为COG5024 Super family Cyclin,可以参与细胞分裂和染色体分区等生物学过程。2.StyCYCB2基因RNAi体系的构建与细胞周期调控功能研究设计并合成3对StyCYCB2基因的靶向shRNA序列,将其重组入YSH-RP005载体中构建干扰表达载体。建立菌液喂饲法转染体系,对处于无性二分裂间、前、中、后和末5个时期的虫体进行干扰实验。以体长、体宽、畸形发生率和基因表达量等为表征,获得干扰效率最高的StyCYCB2-shRNA2进行StyCYCB2基因功能的研究。在一次性添加StyCYCB2-shRNA2的持续观察实验组（C6h和C18h）和补液观察实验组（A6h和A18h）中,5个时期的浮萍棘尾虫细胞发生明显形变,且不同时期干扰组与对照组DNA含量的表达以及StyCYCB2蛋白的荧光表达强度不同。分裂末期提前出现了复制带,造成分裂紊乱。说明StyCYCB2 mRNA表达水平降低,引起了细胞形态结构的改变,进而影响虫体的生长发育,导致细胞不能够正常分裂,并产生致死效应,说明StyCYCB2基因是浮萍棘尾虫细胞分裂增殖过程的重要调控基因。3.基于单细胞转录组测序分析StyCYCB2基因对细胞周期的调控机制（1）StyCYCB2-shRNA2干扰组的单细胞转录组测序分析对一次性转染shRNA2组C6h、C18h和间歇补充shRNA2转染组A6h和A18h,4个shRNA干扰处理的细胞进行了单细胞转录组测序技术分析,共获得54.68 Gb Clean Data,每个样品平均6.835 Gb。对获得的差异表达基因进行GO分类注释,发现干扰处理6h（间期）主要影响细胞膜、细胞器和细胞骨架的构建;干扰处理18h（末期）则进一步影响了核糖体的功能,同时会影响蛋白激酶的活性、离子的转运和RNA的代谢等过程。而且,随着处理时间的延长加重了浮萍棘尾虫受损的程度,造成DNA损伤,进而导致细胞最终裂解死亡。通过KEGG富集分析,表明这些基因参与了多条细胞信号转导通路,包括:PI3K-Akt、AMPK和mTOR代谢通路。此外,综合C6h/CKC6h和C18h/CKC18h两组的GO注释分析结果发现,浮萍棘尾虫细胞分裂增殖过程与StyCYCB2-shRNA2干扰表达载体具有一定的剂量-效应关系,提示StyCYCB2转录表达调控不是一个单向程序化过程。（2）StyCYCB2基因网络调控模式对显著富集的信号通路进行分析,发现StyCYCB2基因与以下重要代谢通路相关:首先其可以与StyCDK2基因相互作用,通过磷酸化过程参与调节浮萍棘尾虫细胞周期的调控;其次与M期的Cyclin A相互作用,通过泛素化途径迅速降解,使CDKl活性丧失,使细胞从M期的中期向后期转化;StyCYCB2基因还可以与mTORC2复合物共同参与调控肌动蛋白细胞骨架的调节过程。因此,StyCYCB2基因是浮萍棘尾虫细胞G2/M期的关键调控基因,与StyCDK2、Cyclin A以及mTORC2复合物形成了一个细胞周期调控网络。
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