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肿瘤发生早期,肿瘤组织通过周围正常组织的血液循环系统供给氧气和营养物质,随着肿瘤快速生长,新生血管形成,但其供血供氧能力远远无法满足肿瘤组织快速增殖的要求,因此,肿瘤组织长期处于缺血缺氧状态。在肿瘤组织微环境中,因能量缺乏而坏死的肿瘤细胞会向细胞间或血液循环中释放危险相关模式分子(Danger-associated molecular-pattern, DAMP),如HMGB1、HSP90等。目前认为,自噬是细胞应对营养缺乏、氧化应激、低氧、感染等恶劣环境因素的生存机制之一,细胞可以通过自噬,直接降解胞内蛋白质大分子回收再利用,抵抗凋亡,在不利环境下存活。我们前期研究表明,肿瘤细胞来源自噬小体(tumor released autophagosome,TRAP)能诱导B细胞成为分泌高水平IL-10、对T细胞应答具有抑制功能的调节性B细胞(IL-10+Breg),但缺氧、缺营养条件是否上调DAMP的表达、胞内DAMP是否被包裹入TRAP以及携带不同含量DAMP的TRAP是否影响IL-10+Breg的诱导还有待进一步研究。目的：1、探讨缺氧、缺营养对肿瘤细胞及其TRAP中DAMP的影响：2、探讨缺氧、缺营养条件下获得的TRAP对诱导B细胞成为IL-10+B细胞及其功能的影响。方法：1、检测不同细胞培养状态TRAP中是否存在DAMP及其含量1.1检测正常状态下人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721、Huh7来源自噬小体中DAMP表达水平；1.2检测不同培养条件HepG2细胞中DAMP表达水平；1.3检测不同培养条件HepG2-TRAP中DAMP含量；2、检测不同培养条件TRAP对B细胞成为IL-10+B细胞的影响,及对IL-10+B细胞功能的影响2.1将不同培养条件HepG2-TRAP与健康供体B细胞共孵育72小时,检测IL-10+B细胞比例,及培养上清中IL-10水平；2.2将不同培养状态TRAP诱导的IL-10+B细胞加入抗CD3单抗刺激PBMC的体外增殖体系,96小时后检测CD4+T和CD8+T细胞CFSE衰减情况。结果：1、不同培养状态募集的TRAP中DAMP含量存在差异1.1不同人肝癌细胞株TRAP中DAMP含量存在差异。通过流式细胞术检测TRAP表面HMGB1含量,我们发现SMMC7721-TRAP 中 HMGB1平均荧光强度(MFI)明显高于Huh7-TRAP和 HepG2-TRAP(102vs31 vs27); Western blot检测TRAP+HMGB1和HSP90含量,通过比较相对灰度值,可知7721-TRAP中HMGB1含量明显高于Huh7-TRAP和 HepG2-TRAP (67%vs45%vs37%),7721-TRAP中HSP90亦高于Huh7-TRAP和 HepG2-TRAP(90%vs68%vs62%)。1.2缺氧上调细胞中DAMP含量,缺营养上调细胞自噬水平。通过Western blot检测细胞中HMGB1、HSP90、LC3含量,通过比较相对灰度值,可知缺氧条件下细胞中HMGB1的含量较正常条件和缺营养条件明显增加(95%vs50%vs68%),HSP90含量亦高于正常条件和缺营养条件(98%vs 38%vs47%)；缺营养条件下细胞中LC3-Ⅱ含量相较于正常条件和缺氧条件明显增加(94%vs 15%vs18%)。1.3缺氧上调TRAP中DAMP含量。通过质谱分析比对缺氧条件TRAP和正常条件TRAP,我们发现HMGB1 和 HSP90在缺氧条件下含量均增加；通过流式细胞术检测TRAP表面HMGB1含量,我们发现缺氧条件TRAP中HMGB1的平均荧光强度(MFI)明显高于正常条件TRAP(128vs29),缺营养条件TRAP中HMGB1的平均荧光强度(MFI)与正常条件相比无明显差异(31vs29);通过Western blot检测TRAP 中 HMGB1、HSP90含量,通过比较相对灰度值,可知缺氧条件下TRAP中HMGB1的含量较正常条件和缺营养条件明显增加(127%vs30%vs48%), HSP90含量亦高于正常条件和缺营养条件(135%vs76%vs120%)。2、缺氧、缺营养状态下募集的TRAP诱导B细胞产生IL-10及抑制T细胞增殖的能力明显强于普通培养条件下募集的TRAP,其中与TRAP的DAMP含量相关。2.1缺氧条件TRAP诱导B细胞成为IL-10+B的比例高于缺营养条件TRAP和正常条件TRAP (7.4%vs4.6%vs3.6%);培养上清中IL-10的含量亦高于缺营养条件TRAP和正常条件TRAP(147vs45vs40)(9pg/mL);其产生的IL-10+B对CD8+T细胞增殖功能的抑制也高于缺营养条件TRAP和正常条件TRAP(43.8%vs48.7%vs50.5%),CD8+T细胞增殖水平均低于对照组的61.7%；CD4+T细胞亦得到相似的结果。2.2通过统计学分析TRAP中HMGB1和HSP90含量与其诱导IL-10+B细胞的相关性,可知TRAP中HMGB1含量与其诱导IL-10+B细胞高度相关,相关系数为0.869,p<0.001;TRAP中HSP90含量与其诱导IL-10+B细胞亦具有一定相关性,相关系数为0.589,p<0.05。TRAP中HMGB1含量与上清中IL-10含量高度相关,相关系数为0.713,p<0.05,TRAP中HSP90含量与上清中IL-10含量不具有相关性,相关系数为0.537,p=0.072,无统计学意义。2.3封闭TRAP中HMGB1可减少其诱导的IL-10+B细胞比例(2%vs3.6%),上清中IL-10的含量亦减少(27vs52)(pg/mL)。结论：肿瘤细胞在缺氧、缺营养状态下释放的自噬小体更能有效诱导B细胞成为具有免疫抑制功能的IL-10+B细胞。