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华北大黑鳃金龟[Holotrichia oblita(Falderman)]是难以防治的地下害虫,给农作物造成严重的损失。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种已被广泛用于农业害虫防治的昆虫病原微生物,其在芽胞形成期可产生主要由cry和cyt基因编码的杀虫晶体蛋白。发掘Bt菌株资源是实现此类害虫绿色防控的重要手段,因此,为了获得对华北大黑鳃金龟具有较高杀虫活性的菌株,本研究以实验室分离的500株Bt菌株材料为基础,通过杀虫活性测定筛选对华北大黑鳃金龟幼虫有活性的菌株,进一步对菌株多样性分析、菌株晶体形态观察和蛋白表达分析、基因鉴定和华北大黑鳃金龟幼虫感染Bt后中肠组织病理切片等方面进行了一系列的研究,其主要结果如下:对华北大黑鳃金龟幼虫有活性菌株的筛选:以实验室分离的500株Bt菌株为材料,通过杀虫活性测定筛选到了42株对华北大黑鳃金龟幼虫具有不同程度活性的菌株,其中有10株14天的校正死亡率大于60%,而261-1菌株7天校正死亡率就达到100%,其余菌株的14天校正死亡率在30%~60%之间。菌株多样性分析:利用本实验室建立的便捷的Bt菌株比较鉴别技术,对这42株菌株进行多样性分析,以42株菌株的基因组为模板,利用优化后的简并引物和PCR扩增体系进行扩增,并利用HinfI对PCR产物进行酶切,通过电泳分析获得了33个菌株的RFLP图谱,分析比较显示它们属于14个不同的菌株类型,从而有效的去除了冗余菌株,结合菌株对华北大黑鳃金龟的杀虫活性数据,选择1126-1、P65-1、QDL47-1、261-1、FTL84、78-2、127-2、78-3、1198-1、S10A2、B8E12、QDL40-2、FCD114、B8E11等14株Bt菌株进行进一步鉴定。菌株晶体形态观察和蛋白表达分析:通过对14株Bt菌株的晶体形态电子显微镜观察,结果显示,78-3、127-2和1198-1菌株能产生双锥体型晶体;261-1、FCD114、P65-1、FTL84、78-2和1126-1菌株能产生球形晶体,而其它5个菌株没有晶体存在。通过SDS-PAGE分析了14株代表菌株表达蛋白情况,结果显示菌株P65-1、1126-1、127-2、78-3、261-1、FCD114、1198-1和78-2能表达典型的约130 kDa的Bt Cry蛋白,QDL47-1和B8E11表达了约97 kDa蛋白,其余菌株表达了少量60 kDa的蛋白。cry基因鉴定:利用cry3、cry8、cry18、cry23、cry37、cry43类通用引物对14株Bt菌株进行进一步基因鉴定,结果显示这14个菌株中,只有P65-1、1126-1、FCD114和78-2四个菌株分别含有cry8Ma、cry8Ca、cry8Ab、cry8Ga、cry8Ea等5类cry8类新基因;而包括对华北大黑鳃金龟幼虫活性最高的261-1菌株在内的其它10个菌株均不含有cry3、cry8、cry18、cry23、cry37、cry43等对鞘翅目害虫有效的杀虫基因。质谱鉴定结果也显示了P65-1、1126-1、FCD114和78-2等菌株有Cry8类蛋白的表达。中肠组织病理学观察:进一步通过对华北大黑鳃金龟幼虫感染Bt后中肠组织病理切片的观察,发现在感染菌株261-1、1198-1、FCD114、1126-1、QDL40-2后,幼虫肠壁细胞组织有明显的病理变化。本研究结果对防治大黑鳃金龟的Bt菌株和杀虫基因资源发掘均具有重要意义。