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研究背景与意义微环境中的细胞外基质、细胞成分及细胞因子的动态平衡,可形成独特空间分布与网络调控模式,影响肿瘤细胞的存活、增殖、分化、侵袭与转移。逃避或防止微环境内免疫细胞的杀伤是肿瘤细胞存活的基础,瘤细胞可能主动或被动参与并影响着微环境,主动抑制细胞免疫功能,诱导其它细胞分泌细胞因了,抑制细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的免疫毒性。细胞免疫功能状态决定肿瘤细胞的存亡,此过程中起主导作用的是CTL细胞,后者直接影响微环境中肿瘤细胞的适应性免疫。肿瘤细胞增生是细胞免疫失效的结果,除了肿瘤细胞自身的免疫逃逸、不能表达免疫细胞识别的抗原、免疫细胞抗原递呈能力弱等因素以外,免疫细胞因子调节的退让,细胞免疫功能被抑制,也是肿瘤细胞不能被杀灭的重要原因。干扰素(interferons,IFN)是应用于肿瘤免疫治疗较早期的细胞因子之一,但并未取得预期的效果。Ⅰ型干扰素包括IFNα和IFNβ等,主要由巨噬细胞、浆样DCs和成纤维细胞产生。ISG15是IFN刺激淋巴细胞后表达的上百种蛋白之一,由ISG15基因编码,在IFNα、IFNβ和IFNγ的刺激下均可表达,但以IFNβ刺激表达增强最明显。B7H4是新近发现的细胞免疫负性共刺激因子。B7H4抑制CD4+T和CD8+T细胞的活化以及细胞因子的释放。Abadi等的研究发现B7H4基因敲除的小鼠,乳腺癌的肺转移被显著抑制,认为宿主间质细胞表达B7H4通过诱导g-MDSCs(骨髓来源的抑制性细胞)的转化而抑制细胞免疫功能,这些为微环境细胞免疫抑制研究提供了重要证据。有研究表明,前列腺癌高表达B7H4与肿瘤的过度生长也有关。但肿瘤细胞高表达B7H4所诱发的免疫抑制问题仍未解决。结直肠癌(CRC)发病率和死亡率均高居全世界恶性肿瘤的第三位,每年新发病例约120万人,预计死亡人数超过60万人。由此,我们预期在结直肠癌中构建“肿瘤细胞—肿瘤微环境”、“肿瘤微环境—肿瘤免疫交互”的研究方案,一方面阐述肿瘤细胞训导微环境的主动性,另一方面展示微环境消减杀伤肿瘤细胞的因素、迎合肿瘤生长的被动性。我们通过免疫组化检测具有1 1年随访资料的结直肠癌组织标本,发现ISG15(共649例)高表达或CD8(共249例)低表达的结直肠癌患者均预后不良。为进一步解析肿瘤细胞与转移微环境的信息交换模式,我们将IFNβ刺激培养前、后的鼠源性结肠癌细胞系CT26.WT接种到Balb/c小鼠体内,构建肿瘤与机体免疫的适应性免疫模型,研究IFNβ作用于肿瘤细胞后,对体内细胞免疫应答的影响。在动物水平我们发现,实验组CT26.WT/IFNβ(IFNβ刺激组)与对照组CT26.WT/Blank(非IFNβ刺激培养组)相比,小鼠的皮下成瘤能力增强;瘤细胞高表达ISG15和Ki-67;瘤组织内CD8+细胞明显减少;肿瘤细胞FADD表达也显著降低。肿瘤细胞与T细胞、DC细胞共培养的结果显示:由实验组CT26.WT/IFNβ小鼠提取的T细胞、DC细胞,可致使肿瘤细胞CT26.WT的凋亡减少。在前期工作中,我们筛选肿瘤细胞抗原递呈和共刺激信号等分子发现,IFNβ作用于结肠癌细胞后,B7H4蛋白的表达上调。我们检测249例具有11年随访资料的结直肠癌临床组织标本得出:肿瘤细胞高表达B7H4与患者的不良预后相关。IFNβ刺激培养后的CT26.WT细胞,移植至Balb/c小鼠皮下后,皮下瘤内B7H4亦高表达。这提示ISG15可能通过抑制肿瘤微环境CTL细胞的募集,并通过影响B7H4的表达而发挥免疫抑制作用,从而抑制微环境对肿瘤细胞的免疫杀伤,协同维持肿瘤细胞存活的微环境,促进了肿瘤的进展。本研究通过构建Balb/c小鼠的皮下瘤模型、腹腔注射模型、脾被膜下注射鼠结肠癌细胞CT26.WT致瘤模型,模拟结直肠癌的自然发生、发展与机体微环境的相互作用关系,探讨ISG15对结直肠癌细胞免疫效应的影响及其与肿瘤预后的相关性。材料和方法1.临床标本收集搜集具有完整随访资料的人结直肠癌组织标本,经过两位病理医生证实病理诊断与肿瘤分期。所有结直肠癌组织标本来自肿瘤根治术,术前未接受放、化疗。患者和/或其家属签署了癌组织标本用于科学研究使用的同意书。2.细胞培养技术人源性结直肠癌细胞株 HT29、HCT116、LS174T、SW480、SW620、LoVo和鼠源性结直肠癌细胞株CT26.WT,统一使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养;鼠源性树突状细胞(Dendritic cells,DCs)使用含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,50ng/ml)、白介素-4(IL-4,25ng/ml)的 RPMI-1640(含1 0%胎牛血清)培养,培养环境均为37℃、5%CO2。3.Western Blot(WB)细胞培养至适当密度,胰酶消化后,收集细胞沉淀提取蛋白上清,使用凯基BCA蛋白含量检测试剂盒检测蛋白浓度,进行蛋白电泳、转膜、5%牛奶封闭、抗体孵育、化学发光。Western Blot(WB)验证ISG15在不同细胞中的表达。在HT29、HCT116、LS174T、SW480、SW620、LoVo 和鼠源性结直肠癌细胞株CT26.WT中,应用IFN β刺激培养前后,进行对照分析,评价ISG15表达的稳定性。同时,在以上IFN β刺激培养前后的细胞中,Western Blot筛查相关免疫分子。4.免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色福尔马林固定人结直肠癌组织及小鼠皮下瘤、肝转移瘤组织标本,经脱水,石蜡包埋,切片后,按照免疫组化的操作方法,显微镜下观察并采集图像。检测ISG15、B7H4、CD8、FADD、Ki-67的表达水平,分析其内在联系。5.免疫荧光(immunofluorescence,IF)染色选择结直肠癌患者组织,进行免疫荧光分析。操作步骤如下:脱蜡;水化;高压修复;山羊血清封闭,4℃过夜孵育一抗,荧光标记二抗,室温,闭光孵育;DAPI复染核,用含抗荧光淬灭剂的封片剂封片,在激光共聚焦显微镜下观察,采集图像。IF实验验证B7H4在人结直肠癌组织中与CD3等分子有无共定位现象。6.细胞功能学实验采用CCK-8增殖实验、划痕实验、Transwell侵袭实验分别检测IFN β刺激对结直肠癌细胞株CT26.WT功能学方面的影响;流式细胞学鉴定免疫细胞(T细胞、DC细胞)表面标记物;流式细胞学检测肿瘤细胞与T细胞、DC细胞共培养后,肿瘤细胞的凋亡情况。7.动物实验取4-6周Balb/c小鼠,SPF级别环境下饲养。将CT26.WT/Blank、CT26.WT/IFNβ两种细胞均采用以下三种方式:皮下注射、腹腔注射、脾被膜下注射,接种在小鼠体内,分别观察两组小鼠的瘤组织生长情况、瘤组织内蛋白的表达及小鼠的生存周期。8.统计学分析实验数据均使用SPSS21.0软件做统计学分析,P值<0.05,差异具有统计学意义。结果1.结直肠癌组织中ISG15、CD8、B7H4的表达:649例具有11年完整随访资料的结直肠癌临床标本,免疫组化检测ISG15在肿瘤组织中的表达水平,结果显示:ISG15的高表达与临床病例的不良预后密切相关(P<0.05,差异具有统计学意义)。在249例临床标本中,检测结果提示B7H4的高表达与临床病例的不良预后密切相关(P<0.05,差异具有统计学意义);评价ISG15与CD8在肿瘤组织中表达的相关性得出,二者呈现负相关关系(P<0.05,差异具有统计学意义)。2.IFNβ刺激前后,肿瘤细胞中IFNβ/ISG15信号通路的表达:选用结直肠癌细胞株 HT29、HCT116、LS174T、SW480、SW620、LoVo 和CT26.WT,提取肿瘤细胞蛋白;同时将细胞因子IFNβ添加至50 ml完全培养基,用该培养基培养以上细胞株,48小时后,提取肿瘤细胞蛋白;Western Blot检测IFNAR2、Jak1、Tyk2、STAT1、STAT2、IRF9、ISG15 的表达水平。结果显示:IFNβ作用48小时后,IFNβ/ISG15蛋白水平的表达显著高于对照组。3.ISG15对鼠源性结直肠癌细胞生物学行为的影响:(1)与5-Fu诱导凋亡组相比,CT26.WT细胞经IFNβ刺激后,可以逆转5-Fu诱导的细胞凋亡。(2)CCK-8增殖实验、Transwell侵袭实验、划痕实验结果提示,CT26.WT/Blank组与CT26.WT/IFNβ组无明显统计学差异。4.免疫细胞表面标记物鉴定:流式鉴定小鼠DC细胞的表面分子标记物:CD11c、CD40、MHC-Ⅱ、CD80,其阳性率均较为可观;磁珠分选所得的小鼠T细胞,采用CD3与CD8双标记,流式检测CD3+T细胞与CD8+T细胞所占比例。5.ISG15对宿主细胞免疫应答的影响:(1)提取小鼠骨髓DC细胞、脾脏分选T细胞,与CT26.WT细胞共培养检测肿瘤细胞的凋亡,结果显示:实验组CT26.WT/IFNβ小鼠来源提取的T细胞、DC细胞,可降低肿瘤细胞CT26.WT的凋亡率。(2)分别将IFNβ刺激培养前、后的鼠源性结肠癌细胞系CT26.WT接种到Balb/c小鼠体内。皮下接种结果显示,,与对照组CT26.WT/Blank(非IFNβ刺激培养组)相比,实验组CT26.WT/IFNβ(IFNβ刺激组)Balb/c小鼠的皮下成瘤能力增强;瘤细胞高表达ISG15、B7H4和Ki-67;瘤组织内CD8+细胞明显减少;肿瘤细胞FADD表达也显著降低。腹腔接种结果显示,实验组CT26.WT/IFNβ小鼠生存周期明显缩短。脾被膜下接种在Balb/c小鼠体内后,取下肝转移灶,免疫组化结果同皮下瘤组织。6.免疫分子B7H4高表达于IFNβ刺激后结直肠癌细胞:将细胞因子IFNβ添加至50 ml完全培养基,终浓度为1000 U/ml,用该培养基培养结肠癌细胞 HT29、HCT116、LS174T、SW480、SW620、LoVo、CT26.WT,48小时后,提取肿瘤细胞蛋白,Western Blot检测结果显示:IFNβ作用48小时后,B7H4在HT29、LoVo、CT26.WT中表达明显增高。7.B7H4在结直肠癌组织中的定位:20例人结直肠癌组织中,免疫荧光实验验证B7H4与CD3、CD20、CD34、CD68、CD163、Actin等分子的表达有无共定位现象,结果显示:B7H4表达于人结直肠癌组织,且与上述分子均不存在共定位现象。结论1.在人结直肠癌组织中,ISG15、B7H4高表达,CD8低表达,三者均与患者的不良预后相关,且ISG15与CD8表达呈负相关关系。2.IFNβ可促使结直肠癌细胞高表达ISG15和B7H4。3.ISG15可能通过抑制肿瘤微环境CTL细胞的募集,促进肿瘤细胞高表达B7H4,从而抑制宿主的细胞免疫杀伤。本研究的创新之处1.“种子”与“土壤”兼顾,构建瘤细胞与微环境之间的桥梁,找到“种子”与“土壤”间的对话机制。2.“攻击”与“防御”并行,提示瘤细胞与细胞毒性细胞的相互训导在微环境中完成,展现两者的相互适应机制和免疫抑制效应,阐述肿瘤发生发展机制的新理念。