论文部分内容阅读
目的：明确转化生长因子-β1(TGF-β1)在CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)发挥体内外免疫抑制功能中的作用，分析TGF-β1体外扩增/诱导的Treg细胞在逆转和预防慢性移植物抗宿主病(cGVHD)鼠狼疮样综合征中的效应，明确Treg细胞体内外扩增和分化的信号通路，为系统性红斑狼疮(SLE)的免疫干预提供新的思路。
方法：采用磁活性标记的细胞分选方法(MACS)分选BALB/c小鼠的CD4+CD25T和CD4+CD25+T细胞，应用流式细胞术(FCM)检测分选细胞纯度。建立体外细胞培养体系，应用Trizol试剂提取培养后细胞总RNA，采用逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)方法检测叉状头/翅膀状螺旋转录因子(forkhead/ Foxp3)的表达水平。同时，采用混合淋巴细胞反应方法，比较新鲜分离的CD4+CD25+Treg、TGF-β1体外扩增的Treg(eTreg)以及TGF-β1体外诱导CD4+CD25-T分化成的Treg(iTreg)细胞的体外抑制效应，应用β液闪烁仪测定CPM值。采用亲代淋巴细胞输注方法建立cGVHD鼠狼疮样综合征模型，以检测血常规(红细胞、白细胞和血小板)、ELISA法检测自身抗体(抗-dsDNA和ANA抗体)、尿蛋白试纸法检测尿蛋白、制备肾标本的石蜡切片、冰冻切片和电镜切片观察病理学改变等作为评价指标。在体外实验的基础上，将新鲜分离的CD4+CD25+Treg、eTreg和iTreg细胞分别于cGVHD鼠狼疮样综合征模型诱导后2周(逆转实验)或诱导前1天(预防实验)输入CB6F1小鼠，前瞻性观测输入不同类型Treg细胞后小鼠的临床表现和实验室指标的变化，评价Treg细胞在体内逆转和预防cGVHD鼠狼疮样综合征中的效应。应用SPSS 11.5软件，定量资料中两组均数比较采用t检验或Mann-Whitney秩和检验，三组及以上组间比较采用方差分析或重复测量数据的方差分析；定性资料的组间比较采用x2检验或Kruskal-Wallis H检验。应用GraphPad Prism 4.0软件，采用Kaplan-Meier方法计算生存率、log rank方法进行统计学分析。
结果：体外实验结果显示，BALB/c小鼠脾脏单个核细经MACS分选后，CD4+CD25+T细胞纯度达98.5％。新鲜分离的CD4+CD25+T细胞在anti-CD3单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)和经过3000 rad照射的同系基因型C57BL/6小鼠脾细胞的刺激下无反应；而当反应体系中加入IL-2时，细胞增殖为原来的4～5倍；若再加入TGF-β1，细胞增殖1～2倍。而新鲜分离的CD4+CD25-T细胞在anti-CD3 mAb和经照射后C57BL/6脾细胞的刺激下能够增殖；与此相比，当反应体系中加入IL-2，细胞增殖1～2倍；若再加入TGF-β1，细胞增殖效应降至原来的300％～40％。新鲜分离的CD4+CD25-T细胞表达极少量的Foxp3，相似于体外anti-CD3 mAb/APC/IL-2/CD4+CD25-T细胞培养体中Foxp3的表达水平；当培养体系中再加入TGF-β1，其诱导生成的iTreg细胞表达FOXp3的水平明显提高，近似于新鲜分离的CD4+CD25+T细胞的表达水平；此外，iTreg细胞体外也具有无反应性和免疫抑制性，同样相似于新鲜分离的CD4+CD25+Treg细胞。即外源性TGF-β1可诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+Treg细胞，进而发挥免疫抑制效应。剂量反应关系显示，在anti-CD3mAb/APC/IL-2/TGF-131/CD4+CD25-T细胞的培养体系中，CD25和Foxp3表达水平随TGF-β1剂量的加大而增高，但升高幅度下降，提示1 ng/ml TGF-β1可能是适宜剂量。在混合淋巴细胞反应中，新鲜分离的Treg、eTreg和iTreg细胞均能够明显抑制CD4+CD25+T细胞的增殖；此外，iTreg细胞与应答细胞在1:1，1:2，1:5，1:10或1:20的比例下，均具有免疫抑制效应，且抑制作用与Treg细胞的剂量呈正相关；而当iTreg细胞与应答细胞的混合培养体系中加入anti-TGF-β1时，不但FoXp3的表达水平降低，且iTreg细胞的抑制效应被部分阻断。体内实验结果显示，当采用亲代淋巴细胞输注后，子代CB6F1小鼠可出现尿蛋白；体重降低，皮肤干涩；红细胞、白细胞和血小板计数降低；抗ds-DNA和ANA抗体的OD值上升；以及狼疮肾炎的病理学改变，如肾小球系膜细胞和内皮细胞增生、系膜增宽、基底膜增厚、免疫复合物沉积等；表明本次cGVHD鼠狼疮样综合征模型诱导成功。将体外新鲜分离的CD4+CD25+Treg、TGF-β1作用下的eTreg和iTreg细胞分别于cGVHD鼠狼疮样综合征模型诱导后2周输入CB6F1小鼠，结果显示，输入3组Treg细胞对已出现自身抗体的模型鼠均有明显的逆转效应，小鼠于输注后抗-dsDNA滴度即开始下降，并伴随其他临床症状和实验室指标的逐渐改善；其中以Treg细胞的体内逆转效应较新鲜分离的CD4+CD25+Treg和eTreg细胞的作用更明显，提示TGF-β1可能作为CD4+CD25+Treg细胞发挥免疫抑制信号的中介，有助于维持体内Treg细胞的数量以及免疫抑制效应的循环。体内预防实验中，将不同剂量的iTreg细胞于cGVHD鼠狼疮样综合征模型诱导前1天输入CB6F1小鼠，结果显示，仅输入1×106iTreg细胞即能延缓和减轻CB6F1小鼠的发病，但以输入25 x106iTreg细胞对自身免疫反应的抑制效应最明显，该组小鼠的表现与正常对照组的差异无统计学意义，提示iTreg细胞可延缓和预防cGVHD鼠狼疮样综合征的发生。
结论：TGF-β1与外周CD4+CD25+Treg细胞的活化、增殖，以及诱导CD4+CD25-T分化为CD4+CD25+Treg细胞密切相关，在维持Treg细胞体内外的免疫抑制功能方面发挥不可或缺的作用，尤其是TGF-β1诱导生成的iTreg细胞具有更明显的逆转和预防cGVHD鼠狼疮样综合征的效应，研究结果为SLE的免疫干预开辟了新的途径。