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睾丸是雄性动物最重要的生殖器官,主要负责产生精子与合成雄激素,前者在生精小管完成,后者由睾丸间质细胞完成。间质细胞合成的雄激素(主要是睾酮)对于维持睾丸正常生精功能至关重要。因此,探讨雄性动物睾丸雄激素合成及其调控机制具有重要意义。然而,雄激素合成不仅受经典的下丘脑-垂体-睾丸轴调控,也受间质细胞内许多信号通路局部调节。近年来,有研究表明甜味受体T1R3 (Taste receptor family 1 subunit 3, T1R3)及其下游 Gα-味导素(G protein α-gustducin,Gα)蛋白在动物睾丸组织中共表达。编码两蛋白的基因同时敲除后,小鼠表现为雄性不育,并伴随精液量减少,精子活力低下、形态异常,生精上皮脱落等表型,提示甜味觉T1R3及Gα是调控雄性生殖的潜在位点,然其具体作用尚未明确。鉴于睾丸甜味觉分子的潜在生物学功能,甜味剂作为食品与饲料添加剂在日常生活与生产中大量使用,可能与逐年递增的雄性生殖障碍发生率存在关联,亟待开展对睾丸甜味受体T1R3及其下游信号参与雄性生殖功能的理论研究。基于这一主题,本论文以小鼠为研究对象,探讨了出生后不同年龄段睾丸甜味受体T1R3及其下游蛋白Gα的表达特性;在此基础上,观察外源甜味剂对成年小鼠睾丸生物学功能及其甜味觉T1R3与Gα分子表达的影响;并解析小鼠睾丸甜味觉T1R3与Gα分子参与睾丸类固醇激素合成的潜在信号机制;通过哺乳期人工甜味剂处理验证小鼠初情期睾丸甜味分子参与间质细胞类固醇激素合成调控cAMP信号机制。通过上述研究,初步揭示了甜味觉受体T1R3及其下游蛋白Gα在睾丸中的非味觉功能。其成果,可为雄性不育机制及甜味剂的合理剂量提供理论储备和技术支持。主要结果如下:1甜味受体T1R3及其下游蛋白Gα在新生仔鼠睾丸组织中的发育表达模式Western blot结果显示,甜味受体T1R3及其下游蛋白Gα在不同发育阶段(新生7 d、断奶21 d、初情35 d、成年56 d及老年1.5 yr)的小鼠睾丸中呈现出先增强后减弱的趋势,且初情期和成年期的表达显著强于断奶期与老年期。免疫组化分析揭示了上述表达变化主要与生精周期中不同阶段睾丸延伸精子细胞与间质细胞T1R3与Gα的差异表达有关。新生期与断奶期小鼠睾丸甜味觉T1R3与Gα仅在间质细胞微弱共表达;进入初情期后,在整个生精周期的变形精子细胞(胞质与Ⅶ-Ⅷ期变形精子尾部)和间质细胞中表达;成年期后两蛋白高表达于整个生精周期延伸精子细胞(且延伸精子尾部表达强于胞质)和间质细胞中;步入老年后,睾丸T1R3与Gα的整体表达水平显著下降。此外,本试验还观察到小鼠初情后,精子细胞残余体和睾丸血管内皮细胞中有T1R3与Gα蛋白表达,而Gα同时在新生7 d小鼠的凋亡精原细胞中存在。总之,出生后小鼠睾丸生精细胞与间质细胞T1R3与Gα的发育表达呈阶段依赖性,且在生精细胞周期中呈现细胞特异性。2甜味剂饮食处理对小鼠睾丸生物学功能及其甜味觉T1R3与Gα的影响甜味剂(糖精钠或蔗糖)饮食处理35 d对成年小鼠睾丸生物学功能的影响呈现出特殊的剂量反应,其中糖精钠引起的反应与睾丸甜味觉信号分子(甜味受体T1R3与其下游蛋白Gα)有关,与蔗糖不同。具体表现为:中剂量与低剂量糖精钠处理组小鼠体重与睾丸重显著增加,血清T略有上升,同时,睾丸甜味觉信号分子T1R3与Gα,以及类固醇激素合成关键因子(中剂量组:StAR、CYP11A1、CYP17A1;·低剂量组:StAR)的表达增强;高剂量组糖精钠处理的小鼠血清生殖激素(T与E2)水平下降,睾丸受损,精子质量差,与其睾丸甜味觉分子T1R3与Gα以及类固醇激素关键因子(StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、17β-HSD)表达减弱同时发生,这可能与激活解离caspase-3有关。此外,高、中剂量蔗糖处理组中小鼠睾丸与精子的异常伴随着解离caspase-3表达增强,而对T1R3与/或Gα味觉分子表达无显著影响。3甜味剂诱导的小鼠睾丸甜味觉T1R3/Gα信号对间质细胞类固醇激素合成的急性影响睾丸内糖精钠与/或hCG微量注射(0 h, 3 h, 6 h和12 h)试验表明睾丸甜味觉T1R3与Gα分子参与的间质细胞类固醇合成与胞内cAMP有关。免疫组化结果显示,成年小鼠睾丸甜味觉信号分子T1R3和Gα与其类固醇合成关键因子(StAR、3β-HSD、CYP17A1和17β-HSD)共表达于间质细胞。经分析发现睾丸内注射未对小鼠睾丸指数及其睾丸组织形态产生器质性影响,各处理组在处理0h,3 h,6 h和12 h后,血糖浓度变化不明显。放射免疫分析显示,糖精钠引起的血清T与E2增加仅在处理后6 h观察到,且hCG和hCG-糖精钠引起的血清E2升高也仅发生在处理后6 h,而血清T在处理3h, 6h和12h均有显著增加。尽管6h糖精钠处理小鼠睾丸T分泌低于hCG和hCG-糖精钠组,但却显著高于生理盐水组与对照组;6 h糖精钠组血清E2水平则与hCG和hCG-糖精钠组相当,且三个处理组均高于生理盐水组与对照组。此外,Western blot与ELISA试验结果表明,6 h糖精钠注射不仅激活睾丸甜味觉T1R3与Gα蛋白表达,也促进了类固醇合成关键因子StAR、CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1的表达,引起胞内cAMP增加。这与预期结果相符,睾丸甜味受体T1R3及其下游Gα的激活,促使胞内cAMP生成,进而诱导间质细胞类固醇激素合成。与此同时,试验结果还表明6 h hCG与糖精钠联合处理减弱了糖精钠组睾丸甜味觉分子(T1R3与Gα)表达的同时,不仅降低hCG诱导的胞内cAMP生成,还抑制hCG或糖精钠组类固醇合成酶(CYP17A1、17β-HSD和3β-HSD)的活性,降低hCG组睾酮分泌量。4哺乳期糖精钠注射的小鼠初情期睾丸甜味觉T1R3与Gα与类固醇激素合成的相关性研究小鼠哺乳期(1 d-21 d)注射试验表明哺乳期糖精钠处理影响小鼠初情期睾丸间质细胞类固醇激素合成与调控。具体表现为:高、低剂量糖精钠注射可提高新生小鼠断奶重与其初情期睾丸指数,其中高剂量糖精钠引起睾丸指数上升与升高的血清T、血清E2、睾丸T浓度及降低的睾丸LH浓度有关,而低剂量糖精钠组的睾丸指数增加与其血清T、血清E2、睾丸T水平的上调有关。免疫组化结果显示甜味觉信号分子(T1R3和 Gα)与类固醇合成关键因子(StAR、CYP11A1、3[3-HSD、CYP17A1 和 17β-HSD)均表达于初情期小鼠睾丸间质细胞中。利用Western blot和real time-PCR技术,进一步分析发现糖精钠注射可引起小鼠初情期睾丸甜味觉信号分子(T1R3和Gα)与类固醇合成关键因子(StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1和17β-HSD)表达上调,但对睾丸T1R2受体无显著影响。此外,ELISA检测结果显示,高、低剂量糖精钠注射组小鼠睾丸cAMP浓度显著升高,但其CHO与TG变化不明显。以上结果提示哺乳期糖精钠注射引起的小鼠初情期生殖激素变化与甜味觉信号分子(T1R3和Gα)介导的下游cAMP信号有关。此外,葡萄糖与胰岛素耐受研究发现,高、低剂量糖精钠处理组小鼠空腹血糖浓度高,葡萄糖耐受能力弱,而胰岛素敏感性无明显变化。