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子宫内膜癌(Endometrial Carcinoma)是女性生殖道常见的三大恶性肿瘤之一,严重影响了广大女性的生殖健康和生活质量,且近年来由于环境因素的变化和女性激素的滥用,其发病率呈显著上升趋势。影响子宫内膜癌预后的因素诸多,其中以肿瘤细胞的分化程度尤为重要。细胞的分化越差,则患者的预后越差。肿瘤细胞与其来源的细胞相比,主要表现为低分化和高度增殖的特性,分化程度越低,细胞增殖越快,肿瘤的恶性程度越高；而分化程度高的肿瘤则接近正常组织,生长缓慢且预后好。既然分化障碍与恶性肿瘤的形成密切相关,那么诱导肿瘤细胞向正常细胞分化,从而达到治疗甚至治愈肿瘤的目的,就成为众多学者的研究方向。但迄今为止,除高效孕激素可用于孕激素受体阳性的高分化子宫内膜癌外,其它有效的可用于复发、转移或低分化癌的诱导分化剂还未见报道。
大量的研究表明,肿瘤干细胞样细胞(Cancer stem cell-like cells,CSCLCs)在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用。干细胞研究在过去十年的飞速发展促进了肿瘤干细胞学说的发展。有学者认为肿瘤组织主要由三种细胞组成:1、具有无限增殖能力和形成新的肿瘤克隆的肿瘤细胞,即所谓的“肿瘤干细胞”；2、具有有限增殖能力但不能形成新的肿瘤克隆的细胞；3、丧失了上述两种能力的肿瘤细胞。其中肿瘤干细胞虽占少数,但由于其具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能等干细胞特性,成为肿瘤发生、发展和转移的根源。维持干细胞多能性的关键因子OCT4在处于未分化状态的CSCLCs中呈高表达,在由不同分化状态细胞组成的肿瘤组织中表达明显降低,而上调OCT4可使干细胞维持其自我更新和无限增殖的能力。这说明OCT4与肿瘤细胞的分化状态密切相关。抑制OCT4的表达有可能诱导肿瘤细胞分化。并且已有学者证实,体外培养的肿瘤细胞株具有肿瘤干细胞样细胞的特性,而裸鼠移植瘤内的细胞则由于体内微环境的变化而呈现出不同的分化状态。
MicroRNAs(miRNAs)是一类小RNA分子,能以不完全互补的方式与其靶mRNA的3’非翻译端的特定区域相互作用,引起mRNA的切割降解,蛋白翻译抑制,进而影响靶基因的表达和作用。大量研究表明miRNA表达的变化与人类多种肿瘤的发生和发展密切相关。但何种miRNA能作用于靶基因进而促进肿瘤细胞向正常细胞分化,以达到治疗肿瘤的目的尚未见相关报道。MicroRNA-145(miR-145)在生殖细胞系以及中胚层来源的组织中呈高表达。因此miR-145在中胚层来源的子宫内膜组织的细胞分化中很有可能起到了关键作用。已有研究证明,在胚胎干细胞中OCT4作为miR-145的靶基因,受其抑制,引起胚胎干细胞向类胚体的各胚层细胞分化。由此本研究设想是否miR-145在肿瘤细胞中也可通过调控信号分子OCT4的表达,促进肿瘤细胞向正常细胞转化呢?
基于以上发现,本研究通过以下三部分进行探索:
1、利用体外培养的Ishikawa细胞以及裸鼠移植瘤模型检测了不同分化状态下miR-145和OCT4的表达及相互作用关系。
2、利用功能获得和功能缺失实验证实上调miR-145可通过抑制OCT4的表达促进肿瘤细胞分化。
3、检测高、低分化子宫内膜癌组织中miR-145和OCT4的表达情况。为寻找一种崭新的肿瘤治疗途径,从而提高子宫内膜癌患者的生存率和治愈率提供新的思路。
目的:检测miR-145和OCT4在体外培养的Ishikawa细胞以及Ishikawa裸鼠移植瘤中的表达情况和作用关系。
方法:利用实时定量PCR(real-time PCR)和流式细胞技术测定体外培养的子宫内膜癌Ishikawa细胞株和裸鼠移植瘤中miR-145和OCT4的表达变化,找出它们相互间的变化规律；并利用荧光素酶报道基因的方法,证明在Ishikawa细胞中miR-145是否直接作用于信号分子OCT4的3’非翻译区(3’UTR),进而影响OCT4的表达；应用实时定量PCR和流式细胞技术,证实miR-145是否通过蛋白翻译抑制来影响OCT4的表达。
结果:
1、体外培养的Ishikawa细胞中OCT4在mRNA和蛋白水平均呈高表达,流式细胞分析显示与ISO type同型对照相比,OCT4阳性细胞高达90％,而在Ishikawa裸鼠移植瘤中OCT4的表达虽可检测到,但与培养细胞相比明显降低,流式细胞分析中OCT4阳性率仅为5％。与OCT4情况相反,miR-145在培养细胞中的表达明显低于在移植瘤中的表达。
2、与阴性对照及miR-Scramble(miR-SC)相比,miR-145成熟体(miR-145mimics)和OCT43’UTR共转染Ishikawa细胞能明显降低报告质粒的荧光强度,差异具有统计学差异(P<0.05),说明外源性的miR-145可直接作用于OCT4；同时对比了单独转染OCT43’UTR和未转染OCT43’UTR的报告质粒荧光强度变化,结果显示转染OCT43UTR的报告质粒荧光强度明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),说明内源性的miR-145也可直接作用于OCT4。
3、在转染miR-145 mimics入Ishikawa细胞48小时后,分别在mRNA水平和蛋白质水平来检测OCT4的表达量。结果显示OCT4的mRNA并未发生明显变化,而其蛋白水平却明显下降(P<0.05)。
结论:本研究首次发现在子宫内膜癌Ishikawa细胞中miR-145与干细胞因子OCT4的表达呈负相关,并与肿瘤细胞的分化程度有关。外源或内源性的miR-145均可作用于mRNA的3’UTR区来直接调控OCT4的表达并对细胞的生长产生影响。miR-145是通过蛋白质翻译抑制来调控细胞内OCT4的表达。
目的:通过功能获得和功能缺失实验,利用子宫内膜癌Ishikawa细胞株和动物模型,展开miR-145通过调控OCT4表达来诱导肿瘤细胞分化的作用机制研究。以证明miR-145在体外和体内均可通过抑制OCT4的表达诱导肿瘤细胞分化。为选择新的肿瘤细胞诱导分化剂提供了新的思路和方法。
方法:
1、利用瞬时转染、流式细胞技术测定体外培养的子宫内膜癌Ishikawa细胞在转染miR-145 mimics和miR-145抑制剂(miR-145 inhibitor)48小时后细胞内OCT4的表达变化；利用瞬时转染和real-time PCR技术观察转染OCT4的小RNA干扰剂(siRNA OCT4)48小时后,细胞内miR-145的变化。
2、利用westernblot和real-time PCR技术观察了细胞转染miR-145 mimics,inhibitor以及siRNA OCT472小时后,子宫内膜癌细胞分化标记物glycodelin的变化。
3、利用以慢病毒为载体的miR-145(lenti-miR-145)稳转细胞株观察了miR-145在体内对OCT4的作用。
结果:
1、转染miR-145 mimics48小时后,与miR-SC相比,显著地下调了细胞OCT4的表达(P<0.05)。转染miR-145 inhibitor48小时后,细胞OCT4水平比SC对照组明显升高(P<0.05)。与其SC对照和空白对照相比,siRNA OCT4转入Ishikawa细胞48小时后,细胞内miR-145的水平明显上调,而OCT4的水平明显下降。(P<0.05)
2、在分别转染miR-145mimic、miR-145 inhibitor和siRNA OCT4以及它们的SC对照入Ishikawa细胞72小时后,与其SC以及空白对照相比,glycodelin的表达水平在miR-145 mimics和siRNA OCT4组显著上调,而在miR-145 inhibitor组明显下降(P<0.05)。
3、体内试验中(in vivo),与SC对照和空白对照组相比,lenti-miR-145组OCT4的表达明显下调,而glycodelin的表达明显上调(P<0.05)。Lenti-miR-145明显抑制了肿瘤的生长,但并未阻止肿瘤的生长。
结论:
1、在Ishikawa细胞中,miR-145的过表达可抑制OCT4的表达水平,而OCT4对miR-145也有负反馈作用。
2、miR-145通过抑制OCT4的表达促进了子宫内膜癌Ishikawa细胞分化,而抑制OCT4表达使内源性miR-145上调同样可促进肿瘤细胞分化。
3、在体内miR-145同样可抑.制OCT4的表达,促进肿瘤细胞分化,并抑制了肿瘤组织的增长。
目的:证实肿瘤的分化程度与肿瘤组织内miR-145和OCT4的表达水平有相关性,进一步验证miR-145的促进肿瘤细胞分化的作用。
方法:利用real-timePCR、流式细胞技术以及HE染色和免疫组化方法,检测高分化和低分化人体子宫内膜癌组织中miR-145及OCT4的表达情况。
结果:
1、miR-145在正常内膜组织和两种癌组织中都能检测到,但与高分化癌和正常内膜相比,低分化癌组中的miR-145表达水平明显降低(P<0.05)。
2、与miR-145相反,OCT4在正常内膜组织中不表达,高分化癌中呈低表达,而在低分化癌中呈高表达(P<0.05)。
结论:miR-145的表达与子宫内膜癌患者肿瘤分化级别呈正相关。OCT4与肿瘤的分级呈负相关。OCT4和miR-145或可成为肿瘤分化程度的标识物,用于子宫内膜癌的诊断。
总之,本课题通过体内、体外以及子宫内膜癌实体肿瘤验证三个部分,首次阐明在子宫内膜癌细胞及组织中miR-145与干细胞因子OCT4之间存在着双向负反馈关系。并利用子宫内膜癌Ishikawa细胞进行了miR-145与OCT4间体内和体外相互干预效应的实验,从基因和蛋白水平,探讨了miR-145作为OCT4的抑制因子,通过下调其表达而抑制肿瘤细胞无限增殖并进一步促进肿瘤细胞向接近正常子宫内膜细胞分化的可能性。最后又在子宫内膜癌患者的实体肿瘤中对miR-145和OCT4的表达变化与高、低分化子宫内膜癌的关系。为寻找新的诱导肿瘤细胞分化的治疗方法提供了新的思路。