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研究背景和目的:脑卒中(Stroke)是一种急性的脑血管疾病,是由于局部血液循环障碍所导致的神经功能缺损综合症,具有死亡率高、发病率高、致残率高的特点,是全世界第二大死亡原因,也是成年人致残的主要原因。脑卒中按照病因可分为缺血性脑卒中(Ischemic Stroke,IS)和出血性脑卒中(Hemorrhagic Stroke,HS),IS约占脑卒中总数的87%。在我国,脑血管疾病的死亡率和发病率显著高于心血管疾病,因此,脑卒中患者需要大量的社会关注和医疗资源投入,寻找防治缺血性脑卒中的生物标志物尤为迫切。Ana M.Gómez-úriz的研究小组发现,在肥胖的缺血性脑卒中患者中,KCNQ1启动子区甲基化水平可作为诊断IS的生物标志物。周淑宇等人的研究发现,在缺血性卒中患者中CDKN2B甲基化水平能够影响主动脉弓的钙化程度。已有大量研究表明,许多疾病以及重要的生物过程受到表观遗传的调控。因此,从DNA甲基化的角度研究其对缺血性脑卒中的影响为我们提供了新的思路。DNA特定位点的甲基化修饰广泛存在于原核生物和真核生物中,能引起染色质的结构、DNA构象、DNA的稳定性及DNA与蛋白质的相互作用方式的改变,从而调控基因的表达,参与代谢途径调节。DNA的甲基化主要发生在基因启动子区CpG岛,其甲基化状态的确定可以通过DNA甲基化测序的方法来实现。目前,从全基因组水平对IS的DNA甲基化水平进行研究未见有报道。因此,本课题应用Illumina Infinium Methylation EPIC Bead Chip(850K芯片)及Methyl Target(目的区域甲基化水平测序),对IS患者与正常人外周血全基因组甲基化的差异水平进行分析,筛选IS患者DNA甲基化水平显著变化的基因,最终,利用生物信息学的方法进行数据分析和挖掘,以期寻找与IS发生、发展相关基因的DNA甲基化分子标志物。IS甲基化分子标志物的发现不仅有助于全面揭示IS发生的表观遗传分子机制,更重要的是可为IS的预防、诊断、个体化治疗及预后提供非常有价值的线索及可靠的科学依据。材料与方法:1.1缺血性脑卒中患者的筛选根据WHO发布的缺血性脑卒中的诊断标准,并排除其它疾病,自2017年3月至2017年10月,在河南中医药大学第一附属医院住院的缺血性脑卒中患者中,按照严格的纳入标准进行选取,其中:第一步初筛人群包括:3例IS患者,分别是2例男性和1例女性,平均年龄为57岁。第二步验证人群包括:60例IS患者,分别是36例男性和24例女性,平均年龄为55岁。1.2健康对照组的选取随机收录与IS组同一时间段体检的受试者,其中:第一步初筛人群包括:对照组为3例,分别是2例男性和1例女性,平均年龄53岁。第二步验证人群包括:对照组为60例,分别是31例男性和29例女性,平均年龄58岁。1.3实验方法1.3.1利用Illumina 850K DNA甲基化芯片对初筛的3例缺血性脑卒中患者和3例健康对照者的外周血液样本进行全基因组DNA甲基化位点检测。对比两组具有显著差异(p<0.05)的甲基化位点,并利用数据库:京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)Pathway、GO分析(Gene Ontology Analysis,GO)进行生物信息学分析,选择与IS相关并有DNA甲基化表达差异的基因。1.3.2扩大样本量至60例IS样本与60例健康对照,进行Methyl Target(目的区域甲基化水平测序)以验证。结果:1.850K DNA甲基化芯片检测得到:622个有统计学意义的甲基化差异Cp G位点,共涉及278个基因(Diffscore值小于‐13或大于13;且Delta_Beta大于0.17或小于-0.17,即为差异甲基化基因)。2.DNA目的片段甲基化测序对19个候选基因(ABCA1,ADAMTSL5,COL9A2,ERCC5,TGFBI,ABCG1,ATP10A,CYP2E1,HOXA4,PCDHB7,ARL4C,KLF11,SULF2,ADARB2,GDF15,CDH15,CAMTA1,SMG6,RNF144b)验证后得到ABCA1,ADARB2,ATP10A,CAMTA1,CDH15,COL9A2,TGFB1共计7个基因,在病例和对照组之间的甲基化水平差异具有统计学意义。(P-value<0.05(Ttest)&P-value<0.05(Utest)&P-value<0.05(Logistic))3.目的片段甲基化测序结果显示:CAMTA1在IS患者组较健康对照组甲基化程度升高,而ABCA1,ADARB2,ATP10A,CDH15,COL9A2,TGFB1在IS患者组较健康对照组甲基化程度降低。结论:1.本课题应用全基因组甲基化芯片及目的区域甲基化水平测序,对IS患者与正常人外周血全基因组甲基化的差异水平进行分析,筛选出ABCA1,ADARB2,ATP10A,CDH15,COL9A2,TGFB1,CAMTA1共7个基因启动子区的Cp G岛甲基化水平可能成为缺血性脑卒中的DNA甲基化分子标志物。2.通过生物信息学分析,ADARB2,ABCA1,ATP10A和TGFB1可能分别通过介导胆固醇转运、磷脂转运以及调节基因表达等功能成为缺血性脑卒中的保护因素。CDH15,COL9A2,CAMTA1可能通过介导细胞间粘附作用、参与胶原蛋白的合成与分解等功能而成为缺血性脑卒中的危险因素。