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甲状腺癌(thyroid carcinoma,TC)是常见的内分泌相关恶性肿瘤之一,也是全球范围内发病率上升速度最快的恶性肿瘤,其中甲状腺乳头状癌(PTC)占80%以上。虽然PTC肿瘤被看作是生长缓慢的肿瘤,主要治疗方式为甲状腺的部分或完全切除,其次通过用放射性碘(131I,RAI)消除残余甲状腺癌细胞组织,这可治愈大多数TC患者。甲状腺癌患者术后需要终身服用甲状腺激素替代治疗,约20-30%的患者发展为局部复发或远处转移,特别是当肿瘤失分化并变的失去摄碘能力,以及原发灶很小就已发生远处转移时,其死亡风险大大增加。当然,有一部分微小癌生长非常缓慢可能生长很多年未被发现。目前,甲状腺癌的发病机制并不清楚,积极寻找致病原因及危险因素深入探讨其发病机制对本病的防治至关重要。已有研究表明雌激素对甲状腺癌的发生和发展具有重要作用。我们课题组的前期研究也表明具有雌激素活性的环境内分泌干扰物双酚A也可以影响甲状腺癌细胞的增殖。但雌激素及双酚A对甲状腺乳头状癌细胞迁移及细胞周期有何影响?这种作用是通过何种受体及信号传导通路发挥作用的?二者的作用有无差异?这些问题是我们的兴趣所在。研究提示双酚A和雌二醇与甲状腺癌的关系将为该病的防治提供一定的理论基础。第一部分双酚A粉和雌二醇对甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力的影响研究背景流行病学调查表明,甲状腺乳头状癌的患病率在育龄期女性比同年龄段的男性高出3-4倍,表明甲状腺癌的发生可能受到女性性激素,特别是雌激素的影响。甲状腺肿瘤发病机制复杂,常见原因可能与家族史、碘的摄入量,电离辐射以及BRAF,RET,NTRK等基因突变有关。而放射线暴露史和甲状腺癌家族史,以及BRAF,RET/PTC和NTRK等常见的体细胞突变并不能解释甲状腺癌的发病的显著性别差异,碘是甲状腺激素合成重要原料,缺乏将会引起甲状腺功能减退、智力低下、身材矮小。目前国际上普遍认为,甲状腺癌的病理类型与碘的摄入量无关,但也有研究显示碘摄入量高的地区甲状腺癌的发病率增高,尤其是甲状腺乳头状癌,本课题组前期动物实验研究也表明,高碘饮食可诱发大鼠甲状腺组织发生乳头状甲状腺癌,但这也并不能解释女性甲状腺癌患病人数的增多,而性激素参与了甲状腺乳头状癌的发生似乎是解释显著性别差异的合理假说。以前的研究已经清楚地表明,雌激素可以影响癌细胞生长,由于在女性月经周期,怀孕和哺乳期间,甲状腺较长时间的暴露于较高的雌激素水平环境中,被认为容易患甲状腺癌。17 β-雌二醇(E2)是人类中最有效的雌激素之一,并且对存在于良性和恶性甲状腺细胞中的雌激素受体具有很高的亲和力。E2还促进雌激素靶器官如乳腺和子宫内膜组织的癌性病变。已有研究表明,乳腺癌患者中甲状腺结节性肿大发生率较高,表明对于雌激素相关的器官,有一种共刺激生长因素参与了甲状腺肿瘤的病理过程。随着社会的发展、环境污染的加重,环境因素对甲状腺肿瘤的影响越来越受到人们关注。具有雌激素特性的内分泌干扰物质(EDCs)也可能参与了甲状腺癌的发生发展。双酚A(BPA)是环境内分泌干扰物的代表物,由聚碳酸酯塑料和环氧树脂的化合组成,存在于塑料,农药,药物,洗涤剂和化妆品等数千种消费品中。动物研究表明,BPA可以低剂量的形式与内源性激素竞争结合激素受体而干扰内分泌信号通路,扰乱人类和其他生物体内源性激素的合成和分泌,并模拟内源性激素的作用,破坏内分泌系统的正常功能,干扰胚胎发育和正常细胞分化。由于BPA在结构上类似于E2,它可能竞争结合基因组和非基因组雌激素受体通过雌激素依赖性途径介导雌激素反应性器官癌症的发生发展,促进如乳腺和卵巢中癌细胞的增殖和迁移。关于BPA与甲状腺癌的研究很少,因此,本研究着重为了阐明E2和具有雌激素活性的BPA在甲状腺乳头状癌中的作用,并以怎样的方式促进甲状腺癌细胞的增殖,以及BPA和E2对促进雌激素相关受体表达水平的差异,探讨雌激素受体在甲状腺癌发病机制中的确切作用,为甲状腺乳头状癌的防治提供一定的理论基础。目的:1.检测不同浓度的双酚A和雌二醇对甲状腺乳头状癌细胞(BHP10-3)增殖活力的影响;2.检测最佳浓度的双酚A和雌二醇对BHP10-3细胞迁移和细胞周期的影响;3.检测双酚A和雌二醇对BHP10-3细胞增殖的影响是否是基于雌激素核受体(ERα/ERβ)和膜受体(GPR30)的表达。方法:1.采用不同浓度的双酚A(10-3-10-8M)和雌二醇(10-4-10-9M),干预人甲状腺乳头状癌细胞(BHP10-3),在不同时间点(24h、48h、72h)采用CCK-8实验方法检测BHP10-3细胞增殖活力,观察细胞生长曲线,检测BHP10-3细胞活细胞数的变化,确定BPA和E2促进细胞增殖的最佳浓度和时间。2.采用细胞划痕实验判断双酚A和雌二醇对BHP10-3细胞迁移能力的影响。3.利用最佳浓度的双酚A和雌二醇干预BHP10-3细胞,分别在不同时间点(24h、48h、72h)采用流式细胞术检测细胞DNA含量及计算细胞增殖指数,分析BPA及E2对细胞周期相的影响;4.采用免疫荧光法确定雌激素核受体(ER α/ERβ)和膜受体(GPR30)在人甲状腺乳头状癌BHP10-3细胞内的表达和定位;结果:1.不同浓度的BPA和E2刺激甲状腺乳头状癌细胞(BHP10-3),BPA和E2的促增殖作用表现为倒置的“U”型曲线,呈浓度和时间依赖性,最佳增殖浓度分别为10-7M和10-8M,活细胞数随着时间延长而增多;2.细胞划痕实验显示BHP10-3细胞在双酚A和雌二醇的作用下,促进其运动和迁移。3.流式细胞细胞周期相显示,双酚A和雌二醇均可促进BHP10-3细胞从G0/G1进期展到S期,24h为G0/G1进展到S期的最佳时间;4.运用免疫荧光检测方法,在激光共聚焦显微镜下观察到雌激素核受体ERα、ERβ和膜受体GPR30共表达于BHP10-3细胞中,ERα主要表达于细胞核内,部分分布于细胞膜上;而ERβ完全表达于细胞核内;雌激素膜受体GPR30则主要分布于细胞膜,部分集中于细胞质内的浆膜或内质网,双酚A和雌二醇可增强其表达浓度。结论:1.双酚A具有显著的雌激素活性,低剂量的双酚A(BPA,10-7M)和雌二醇(E2,10-8M)即可发挥其生物学活性,促进甲状腺癌细胞增殖、迁移。2.雌激素受体ER α、ER β和GPR30共同表达于人甲状腺乳头状癌细胞(BHP10-3)中,双酚A和雌二醇一样促进甲状腺乳头状癌细胞(BHP10-3)的增殖可通过雌激素受体依赖性途径。第二部分双酚和雌二醇诱导甲状腺乳头状癌细胞产生mER α和GPR30 及对 AKT/mmTOR通路的影响研究背景PI3K/Akt通路在致癌过程中的作用已经被广泛的探索和报道,最近的研究证实这一途径与TC,尤其是与FTC和ATC的发病机制关系密切。关于PI3K/Akt/mTOR通路的激活有多重方式,越来越多的亚临床或临床数据支持这一途径可能代表一种治疗TC潜在目标,而针对PI3K/Akt/mTOR的口服药物已成功的治疗多种恶性肿瘤,正逐渐被广泛应用。特别是当甲状腺肿瘤对传统的放射性碘治疗产生抵抗的时候,即难治性甲状腺癌的治疗,需努力去确定这些途径中可能的治疗目标。研究表明雌激素促进雌激素反应性器官恶性肿瘤的发生发展可能是通过结合ERs而激活P13K/Akt/mTOR通路的激活而致。由于甲状腺乳头状癌显著的性别差异,我们推测雌激素受体参与了其发病,而具体哪种受体参与P13K/Akt/mTOR通路的激活尚不清楚。由于BPA在结构上类似于E2,它是否也可通过雌激素受体依赖性途径激活该通路仍有待确定。而运用单独靶向或双重受体抑制剂是否可抑制该通路的激活也是本文关注的重点。目的:1.检测双酚A(10-7M)和雌二醇(10-8M)干预BHP10-3细胞后,BHP10-3细胞中ERα、ERβ、GPR30等雌激素相关受体基因和蛋白表达水平的变化。2.明确PI3K/Akt/mTOR通路在甲状腺乳头状癌发病中的作用,以及明确双酚A是否类似于雌二醇可激活P13K/Akt/mTOR通路。3.了解选择性雌激素受体拮抗剂1C1182,780和特异性GPR30拮抗剂G15是否可通过抑制雌激素受体的表达而阻断BHP10-3细胞PI3K/Akt/mTOR(PAM)通路的激活。4.比较双酚A和E2在促进肿瘤进展中的作用差异。方法:1.通过Real-time PCR和Western blot实验技术分别在24h和48h检测双酚A(BPA)和雌二醇(E2)干预后的人甲状腺乳头状癌细胞(BHP10-3)中ERα、ERβ、GPR30等雌激素相关受体基因和蛋白表达水平的变化;2.通过Real-time PCR和Western blot实验技术明确选择性或特异性雌激素受体拮抗剂ICI(10-6M)、G15(10-8M)预处理BHP10-3细胞1h后,是否可抑制雌激素相关受体基因和蛋白的表达。3.利用最佳浓度的BPA(10-7M)和E2(10-8M)在不同时间点(0,5,15,30,60,90min)干预BHP10-3细胞,用Western blot实验技术检测Akt/mTOR分子的磷酸化水平,明确达到最大效应的时间点。4.利用适当浓度的雌激素受体相关拮抗剂ICI(10-6M)、G15(10-8M)预处理BHP10-3细胞1h,再用BPA和E2刺激细胞,用Western blot实验方法检测AKT/mTOR磷酸化水平的变化。结果:1.运用Real-time PCR和Western blot实验技术再次证实双酚A(10-7M)和雌二醇(10-8M)可明显增强ERα、ERβ和GPR30在BHP10-3细胞中的表达。2.双酚A(10-7M)和雌二醇(10-8M)均可迅速刺激甲状腺乳头状癌细胞(BHP10-3)中Akt/mTOR发生磷酸化,最佳时间均为30分钟。3.运用选择性雌激素受体拮抗剂ICI(10-6M)预处理BHP10-3细胞后,ICI表现为可抑制BPA和E2诱导的ERα蛋白和基因表达,也可选择性的抑制E2诱导的ERβ的蛋白或基因水平,但是对于BPA刺激的ERβ蛋白和基因的表达可能表现为无抑制作用,基于ERα、ERβ受体不同作用性质,ICI或可通过抑制ERα的表达而达到抗肿瘤作用。4.ICI在没有BPA和E2干扰的情况下可增强BHP10-3细胞GPR30蛋白和基因水平;但特异性雌激素受体拮抗剂G15(10-8M)可显著抑制E2促进的GPR30表达,但对于BPA的激动作用无明显影响。5.特异性雌激素受体激动剂G1(10-8M)的作用类似于BPA或E2,即特异性增强GPR30的表达。6.BPA和E2均可显著升高p-Akt的水平,用G15预处理BHP10-3细胞1h后,E2组中p-Akt和p-mTOR蛋白水平均较前明显下降,即G15可阻断E2对于该通路的激活作用,而对于BPA组中p-Akt/p-mTOR的表达水平并无影响。用ICI+G15联合预处理BHP10-3细胞,可进一步增强单用G15的抑制作用,但对BPA的抑制作用仍不明显。7.特异性雌激素受体激动剂G1类似于BPA或E2的作用可激活Akt/mTOR通路,增强Akt/mTOR蛋白磷酸化水平。8.BPA和E2对于激动ERα、ERβ和GPR30表达能力无显著性差异。结论:1.Akt/mTOR信号通路参与了甲状腺乳头状癌的发生发展,促进了肿瘤细胞的生长。2.Akt/mTOR通路的激活可能是基于上游雌激素受体(mER和GPR30)的过表达而完成。3.ICI可显著抑制BPA和E2诱导的BHP10-3中ERα的表达,由于ERα和ERβ的不同作用特点,单独应用IC1,其拮抗作用表现为不确定性。4.G-15能显著抑制E2诱导的雌激素受体及下游通路分子的表达,从而达到抗肿瘤细胞增殖作用,但对于BPA无抑制作用;ICI和G15对于E2诱导的GPR30及下游通路分子的表达具有协同性。5.BPA和E2类似于特异性激动剂G1的作用均可显著促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖,二者之间比较无显著性差异。-6.BPA可以通过基因组转录途径或非基因组途径促进甲状腺乳头状肿瘤的进展,但激活雌激素受体的方式不完全相同于E2,也可能不完全通过雌激素受体依赖性途径激活下游通路。