沙门氏菌O、H抗原PCR检测方法及invE蛋白表达的研究

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沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中一种非常重要的人畜共患性病原细菌。沙门氏菌感染有多种表现的临床症状,除伤寒、副伤寒引起败血症外,其他临床症状主要有食物中毒型,表现为急性胃肠炎和严重中毒症状;菌痢样腹泻型;消化不良性腹泻;细胞毒反应等等。动物感染沙门氏菌后可加重病态或死亡率,或者降低动物的繁殖生产力,给国家经济造成巨大的损失,同时严重威胁着人们的身体健康和畜牧业的健康发展,因此具有重要的公共卫生意义。 本研究从广州市内多家超市及广州市邻近地区的多个养殖场采集了549份样品,通过选择性培养基分离培养、生化鉴定、BIOLOG全自动细菌鉴定系统鉴定、API20E试剂条鉴定和血清型鉴定等方法,共分离鉴定出沙门氏菌19株,检出率为3.46%。19株沙门氏菌中有S. typhimurium、S.derby各6株,各占31.58%(6/19);S. enteritidis3株,占15.79%(3/19);S.pullorum、s. anatum、s.yalding、S.shubra各1株,各占5.26%(1/19)。本研究进一步对分离到的19株沙门氏菌进行了药敏试验,结果表明大部分沙门氏菌分离株对头孢他啶、环丙沙星、头孢噻肟、多粘菌素B、诺氟沙星、洛美沙星敏感;对克林霉素、罗红霉素等有耐药性。本研究对沙门氏菌常见血清群分离株的invE基因进行扩增、克隆测序及序列分析,结果表明沙门氏菌常见血清群分离株与国外2株分离株的核苷酸序列相似性达97.6%~100%,表明沙门氏菌的invE基因保守性强,适合作为检测沙门氏菌的靶基因。 本研究针对沙门氏菌的wzx基因和tyv基因,设计出可以鉴定沙门氏菌常见血清群的特异性引物,建立了沙门氏菌常见O抗原的PCR检测方法;本实验针对沙门氏菌的fliC基因和fljB基因,设计出可以鉴定沙门氏菌的常见H抗原的特异性引物,建立了沙门氏菌常见H抗原的PCR检测方法,并以19株沙门氏菌分离株和实验室保存的菌株为材料,对该方法进行了灵敏度、通用性、特异性等实验,结果表明该方法特异性强、灵敏度高。 本研究进一步针对沙门氏菌的invE基因设计另一对特异性引物,以S. typhimurium为模板,通过PCR方法扩增出invE基因片段,然后将该片段克隆到原核表达载体pET—32a中,利用IPTG诱导表达获得约60KDa的重组蛋白,Western—blotting检测表明,该重组蛋白与兔抗a.typhimurium阳性血清具有良好的反应性。
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