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目的:通过分析血浆miRNA表达谱筛选可能成为非贲门区胃癌及其癌前病变的候选血浆miRNA生物标志物,并进一步验证它们对非贲门区胃癌及其癌前病变的鉴别作用,为探索更加理想的非贲门区胃癌及癌前病变人群筛查和辅助临床诊断的肿瘤标志物提供实验基础。内容:应用Taqman低密度芯片(TLDA)检测分析血浆miRNA表达谱,筛选可能成为非贲门区胃癌及其癌前病变的候选血浆miRNA生物标志物;扩大样本含量应用RT-qPCR对候选血浆miRNA标志物验证,定量检测其血浆表达水平并比较组间差异,评估它们对非贲门区胃癌及其癌前病变的鉴别作用;在验证阶段血浆miRNA表达定量检测的基础上,应用统计学分析探索血浆miRNA与胃癌基本临床特征的相关性,明确临床特征中多因素对血浆miRNA表达的协同影响作用。方法:设立对照组、癌前病变组、Ⅰ期胃癌组、Ⅳ期胃癌组4组,每组入选15例研究对象,取每例等量血浆70μl组成4组混合血浆样本,应用TLDA芯片检测各组混合血浆样本miRNA表达谱,选择具有实际表达(Ct值小于35)且组间有显著表达差异的血浆miRNA作为验证阶段的候选血浆miRNA标志物。扩大样本含量对照组22例、癌前病变组20例、Ⅰ期胃癌组26例、Ⅳ期胃癌组28例,取每例血浆200μl,应用RT-qPCR检测所有候选miRNA在每例血浆样本中的表达水平(Ct值),以cel-miR-39为外源性参照物,计算相应的相对表达量(△Ct值)。采用秩和检验的统计学方法,分析每个候选miRNA血浆相对表达量的组间差异。对于组间表达存在差异的miRNA,应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)评价其对于非贲门区胃癌及其癌前病变的诊断价值。以qPCR检测并计算血浆miRNA △Ct值为基础,根据△Ct值的中位数将每个miRNA分为2组:低表达组和高表达组。收集入选研究对象基本临床信息:年龄、性别、肿瘤分化、肿瘤病例生存时间和终点事件。分别应用Pearson相关分析、秩和检验、Kaplan-Meier和Cox回归生存分析、χ2检验对于年龄、性别、肿瘤分化、预后生存和每个miRNA表达进行统计学分析。结果:筛选和验证阶段4组入选研究对象年龄、性别、病变部位均匹配。TLDA芯片检测分析血浆miRNA表达谱筛选出具有实际表达且组间有显著表达差异的血浆miRNA共25个,其中依病程进展呈现上升表达趋势的12个,呈降低表达趋势的13个。验证阶段分析显示,在25个候选血浆miRNA中,16个miRNA显示出至少在2组间存在表达差异,其它miRNA组间表达无统计学差异。在具有表达差异的 16 个 miRNA 中,let-7d、let-7e、miR-15b*、miR-26a-1*、miR-100、miR-106b*、miR-142-3p、miR-335*、miR-340*、miR-379、miR-485-3p、miR-652、miR-654-3p在Ⅰ期和Ⅳ期胃癌组的表达显著低于对照组和癌前病变组,而在Ⅰ期与Ⅳ期胃癌组间、对照组与癌前病变组间表达无统计学差异;miR-1274A、miR-1290、miR-1291在Ⅳ期胃癌组表达显著高于对照组、癌前病变组和Ⅰ期胃癌组,而后者3组间表达无统计学差异。Pearson相关分析显示,12个血浆miRNA表达与年龄呈显著性相关,且随年龄增长miRNA血浆浓度呈降低趋势;性别、肿瘤分化分别与miRNA表达的秩和检验显示,二者对miRNA血浆浓度无显著影响。胃癌病例生存Kaplan-Meier分析显示肿瘤分期和分化与生存时间显著相关,Ⅰ期胃癌和中分化胃癌分别较Ⅳ期胃癌和低分化胃癌生存期长;miR-1274A血浆浓度与胃癌预后生存显著相关,miR-1274A血浆表达高者生存期短。将肿瘤分期和分化作为协变量进行miRNA表达与生存的Cox回归分析显示miR-31血浆浓度与生存相关,miR-31血浆浓度高者生存期长。在Ⅳ期胃癌的分层生存分析中,Kaplan-Meier分析显示miR-31与Ⅳ期胃癌生存相关,miR-31血浆浓度高者生存期长,将Ⅳ期胃癌病例生存期以6个月为截点分别与血浆miRNA表达进行χ2检验显示miR-1274A血浆高表达与Ⅳ期胃癌短生存期显著相关。结论:TLDA和RT-qPCR证实了血浆中miRNA的存在和可检测性;TLDA筛检出非贲门区胃癌及癌前病变可能的候选miRNA标志物,是无前提假设下进行全基因组miRNA筛选的有效工具。本研究发现13个可能成为非贲门区早期胃癌及胃癌筛查的血浆miRNA标志物,3个可能成为非贲门区胃癌远处转移和远处复发筛查的miRNA标志物。此外,发现12个血浆miRNA表达与年龄具有统计学相关性。生存分析进一步证实肿瘤分期对胃癌预后生存具有显著影响,并发现miR-1274A和miR-31血浆表达水平对非贲门区胃癌或Ⅳ期胃癌预后生存具有显著影响,可能成为非贲门区胃癌预后评估的生物标志物。由于研究对象纳入标准和样本含量的局限性,这些miRNA生物标志物的诊断价值有待扩大样本进一步验证。