葡萄扇叶病毒脱除与检测技术研究

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liangmingming
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本研究用热处理、热处理+茎尖培养、热处理+茎尖培养+板蓝根、超低温+茎尖培养四种方法对葡萄扇叶病毒进行了脱除,并对葡萄扇叶病毒的Dot-ELISA、dsRNA、RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术进行了比较研究,从而建立了葡萄扇叶病毒脱除和病毒检测的技术平台,结果如下: 1.Dot-ELISA对大田37株魏可葡萄进行病毒检测,有29株带毒,检测率为78.4% 2.用dsRNA检测了同时感染卷叶病毒和扇叶病毒的植株,电泳结果显示有两条带,一条大小为17000bp左右,初步认为是卷叶病毒;另一条大小在3700bp左右,认为是扇叶病毒,但通过RT-PCR检测发现,dsRNA方法显示3700bp左右片段的植株扩增出312bp左右大小的目的条带,证明确实感染扇叶病毒,而dsRNA方法显示17000bp左右片段的植株并未扩增出300bp左右大小的目的条带,可能并非感染卷叶病毒Ⅲ。 3.以葡萄叶片为材料通过改进的CTAB法、SDS-酸酚法和分步离心法提取葡萄总RNA,结果发现改进的CTAB法可以从组培苗和大田苗叶片提取到完整的RNA,SDS-酸酚法可以从组培苗叶片中提取完整的KNA。 4.比较RT-PCR、IC-RT-PCR检测结果发现,RT-PCR的检出率为69.2%,而IC-RT-PCR为92.3%,说明IC-RT-PCR比RT-PCR灵敏。 5.将克隆到的6条葡萄扇叶病毒保守区核苷酸序列与GENBANK上登录的核苷酸序列(登录号:NC-003623)进行同源性比较,结果发现有3条完全同源,其它3条分别在不同的位置发生碱基突变,同源性为99%。将这3条序列登录GENBANK,登录号分别为DQ672565、DQ672566、DQ672567,并进行了氨基酸聚类分析。 6.用热处理+茎尖培养脱除病毒,热处理开始时间以转接后组培苗的培养时间20天为最佳,成活率100%,且腋芽没有萌发;小于0.2mm,暗培养3天的茎尖为好,此时茎尖分化率为95.2%,脱毒率为100%。 7.热处理+板蓝根+茎尖培养脱除病毒时,以培养基中添加2.0g/L板蓝根为宜,此时小于0.2mm的茎尖脱毒率为100%;0.2~0.5mm之间茎尖脱毒率为86.0%;大于0.5mm的茎尖脱毒率为81.8%。
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