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禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可感染鸡、鸭、火鸡和其他禽类,使宿主出现气囊炎、蜂窝组织炎、输卵管炎、腹膜炎等症状,是养禽业最常见的致病菌之一。LuxS/AI-2型密度感应系统广泛存在于革兰氏阳性和阴性细菌中,可产生种间通用信号分子AI-2,并调控细菌的多种生理功能。AI-2信号由胞外转运至胞内需要借助于细胞的AI-2受体,目前哈维氏弧菌的LuxP型受体和鼠伤寒沙门的LsrB型受体已被证实存在多种细菌中。但关于APEC的AI-2受体,目前尚缺乏相关报道。本研究旨在通过建立APEC的AI-2受体检测方法,运用蛋白组学技术,筛选AI-2调控的靶蛋白,为进一步探究LuxS/AI-2型密度感应系统在APEC中的调控通路及鉴定AI-2受体提供参考,从而为从细菌群体角度防治APEC提供新的思路。1.AI-2受体蛋白检测的方法建立为了建立AI-2受体检测方法,本研究首先通过基因缺失的方法,构建大肠杆菌BL21(DE3)的luxS基因缺失株,成功获得不能产生AI-2的BL21(DE3)缺失株,并命名为BL21(DE3)?luxS。运用pColdTF质粒构建了鼠伤寒沙门氏菌LsrB蛋白的原核表达载体pColdTF-lsrB,并分别转化至BL21(DE3)?luxS和BL21(DE3)中,经体外诱导表达,成功获得具有生物学活性的Lsr B蛋白。运用纯化的LsrB对AI-2分子进行了结合与释放实验。实验结果表明LsrB对AI-2分子具有结合能力,且结合能力是建立在LsrB的活性结构基础上;活性结构丧失后的LsrB不能够结合AI-2,并释放已结合AI-2。通过建立AI-2受体的检测方法,为进一步开展APEC的AI-2受体筛选奠定基础。2.运用蛋白组学技术筛选APEC中AI-2的靶蛋白对APEC内化外源性AI-2的动力学研究表明,加入AI-2后第3 h时,APEC对AI-2内化效率最高(72%)。但运用荧光定量PCR(qPCR)技术,对APEC内化外源性AI-2后luxS、pfs、iss和tsh的转录水平检测结果表明,AI-2内化5h时,上述基因转录水平变化最显著(p<0.001)。上述研究结果表明从APEC对AI-2的内化和AI-2对APEC的基因调控是不同步的。为了研究AI-2对APEC的靶蛋白的调控作用,本研究结合APEC内化外源性AI-2的内化动力学结果,选择AI-2加入APEC中5 h时的菌体,运用非标记定量蛋白组学方法检测受AI-2调控靶蛋白,同时设立不加AI-2的APEC对照组,比较两者蛋白表达差异,筛选APEC中受AI-2调控的靶蛋白。非标记定量蛋白质组学结果显示共检测到受AI-2调控的显著性差异蛋白质479个,对差异蛋白的生物信息分析结果表明,受AI-2调控的靶蛋白主要参与APEC的代谢和信号转导过程。3.AI-2靶基因缺失株的构建及生物学特性分析对运用蛋白组学技术筛选到的AI-2靶蛋白进行分析,选取5个受AI-2调控的靶蛋白基因(3630、tufB、phoH、kgtP和yjaE),运用Red同源重组的方法,成功获得上述基因的缺失株。对构建的缺失株进行AI-2内化检测,结果表明,与野生株相比,上述基因的缺失,并不能显著影响AI-2的内化。本文推测选取的5个AI-2靶基因,不是APEC的AI-2受体基因,不参与APEC对AI-2的内化。对缺失株的LD50检测结果表明,缺失株对樱桃谷鸭的致病能力未呈现明显变化(出现10倍或以上的LD50变化可认为毒力改变),表明本研究选取的5个AI-2靶基因,不参与对APEC的毒力调控。本研究结果表明,选定的该5个AI-2调控基因可能参与APEC中的某些受LuxS/AI-2型密度感应调控的其他生理过程,具体的机制仍有待深入研究。本研究通过建立AI-2受体检测方法、鉴定AI-2调控的靶蛋白和构建靶基因的缺失株并开展相关的生物学研究,为进一步开展APEC中AI-2受体及其调控作用提供参考。