【摘 要】
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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种具有高度特异性,对环境友好的微生物杀虫剂,其cry基因也是应用最为广泛和最有潜力的抗虫基因。本试验从山东省土壤中分离Bt菌株,
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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种具有高度特异性,对环境友好的微生物杀虫剂,其cry基因也是应用最为广泛和最有潜力的抗虫基因。本试验从山东省土壤中分离Bt菌株,然后通过生物测定筛选对鳞翅目夜蛾科昆虫具有高毒力的菌株,并对筛选出的高毒力菌株的蛋白组成和杀虫蛋白基因型作相应的研究,在此基础上,分离克隆新型的Bt的cry基因,研究该基因的表达和杀虫活性。本试验主要结果如下:1采用芽孢杆菌选择性培养基与晶体染色相结合的方法,从山东省采集的750份土样中分离出Bt菌株57株,Bt菌株的平均分出率为7.6%。这些Bt菌株的晶体形态包括菱形、圆形等形状。2以粘虫和甜菜夜蛾初孵幼虫为试虫进行高毒力菌株的初筛,菌液浓度为6.0×108cfu/mL时,对粘虫初孵幼虫校正死亡率高于50%的菌株有QCL-1、QCY-3、QJN-1、WRC-1、WZ-1;对甜菜夜蛾初孵幼虫校正死亡率高于50%的菌株有QCL-1、WRC-1、HJY-1。对Bt菌株不同成分生物测定,试验结果表明菌株QCL-1对几种夜蛾科害虫的毒力主要来自于芽孢和晶体混合物,菌株QCL-1对甜菜夜蛾初孵幼虫的毒力显著高于标准菌株HD-1,对粘虫和粉纹夜蛾初孵幼虫的毒力与标准菌株HD-1相当。3 SDS-PAGE分析菌株QCL-1杀虫晶体蛋白主要为130kDa和70kDa两种,利用cry基因的PCR-RFLP方法鉴定菌株QCL-1中含有cry1Cb、cry1Fa、cry1Fb、cry2Ab和未知的cry2A类基因。4以菌株QCL-1质粒为模板,利用设计的cry2A类特异性引物FY2A5和FY2A3,PCR扩增出1.9kb的目的片段,将其克隆到表达载体pET-21b(+),构建了T7启动子控制的大肠杆菌重组表达质粒pET21b-cry2Ac。序列分析表明,该基因的编码框由1872个碱基组成,该基因编码的蛋白质由623个氨基酸组成,其中亲水性氨基酸占38.35%,疏水性氨基酸占45.26%,酸性氨基酸占6.90%,碱性氨基酸占9.48%。蛋白质的分子量为69.7kDa,等电点为8.825,为弱碱性蛋白质。该基因编码的氨基酸序列与已公布的Cry2Ac蛋白的氨基酸序列均不同,氨基酸序列同源性在97.4%~99.7%之间。该基因的核苷酸序列已经在GenBank登录(GenBank accession EF405952),并被Bt基因国际命名委员会确认为一个新的cry2Ac基因,正式命名为cry2Ac10。5将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达70kDa的蛋白。Cry2Ac10蛋白生测结果表明,该蛋白对棉铃虫、粘虫和粉纹夜蛾初孵幼虫具有高毒力,同时对甜菜夜蛾初孵幼虫生长有抑制作用,其中对棉铃虫和粘虫初孵幼虫的LC50分别为30.0μg/g和16.7μg/g。
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