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膀胱癌是泌尿道最常见的恶性肿瘤。根据美国国立卫生院最新统计数据表明：2012年美国膀胱癌新发病例为73510，死亡病例为14880。在我国，尽管无明确的统计数据，但是现有的临床实践和我国老龄化社会问题的逐渐显露，我们有理由推断，在未来的几年内，膀胱癌的发病率必将逐年上升。在膀胱癌的发生发展过程中，癌细胞与宿主经过了免疫监视、免疫平衡、免疫逃逸三个阶段。而癌细胞的免疫逃逸使膀胱癌患者的临床治疗更为复杂。因此，近年来对膀胱癌免疫逃逸机制的研究一直是泌尿系肿瘤领域的重要研究方向。免疫细胞杀死肿瘤细胞过程涉及免疫细胞向肿瘤细胞传递凋亡信号以及凋亡信号在肿瘤细胞内的转导。然而绝大多数有关肿瘤细胞免疫逃逸的研究主要致力于免疫细胞向肿瘤细胞传递凋亡信号受阻方面，如肿瘤细胞抗原的缺失、肿瘤细胞抗原递呈受阻、肿瘤细胞分泌免疫抑制因子和肿瘤细胞表观遗传的改变等。尽管如此，现有的研究表明：免疫细胞向肿瘤细胞传递凋亡信号的通路并未完全受阻，即发生免疫逃逸的肿瘤细胞仍然可部分接受免疫细胞传来的凋亡信号。因此，我们推测膀胱癌细胞内凋亡信号的传递受阻可能是造成膀胱癌细胞发生免疫逃逸的重要原因之一。细胞内信号的调控极其复杂，近十多年的研究发现，微小RNA(microRNA或miRNA)在细胞内信号调控中占据着显赫的地位，其调控机制可概括为：成熟的miRNA组装到沉默复合体并通过碱基互补配对方式识别靶基因mRNA，根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻译蛋白来调控细胞内信号的传递。而本研究是在前人实验数据证实膀胱癌组织中miR-221表达明显高于正常膀胱组织的基础之上，初步探讨miR-221靶向作用于PUMA基因在膀胱癌免疫逃逸中的分子机制。目的：初步探讨miR-221沉默PUMA在膀胱癌免疫逃逸中的作用方法：检测转染miR-221抑制剂后对人膀胱移行细胞癌T24、5637、J82细胞生长的影响。人工合成2’-O-methyl(OMe)、FAM修饰的miR-221抑制剂（has-miR-221inhibitor）、FAM修饰的无意义阴性对照组序列（Negative control）。将T24、5637、J82细胞各分成3组：①转染miR-221抑制剂组（Tansfection of miR-221inhibitor）②阴性对照组(Negative control)③控制组（Control），用转染试剂lipofectamineTM2000，将miR-221抑制剂、Negative control FAM分别转染T24、5637、J82细胞，采用MTT检测转染24h、48h、72h后细胞增殖活性，选取最优转染时间。转染48h后，qRT-PCR检测miR-221的表达；RT-PCR、western-blot检测miR-221靶基因PUMA及相关凋亡基因Bax、Bcl-2的mRNA、蛋白表达水平；流式细胞术检测细胞凋亡率的改变、AO-EB染色检测细胞凋亡的形态学改变。转染48h后检测细胞侵袭性改变。将人膀胱移行细胞癌T24、5637、J82细胞各分为①转染miR-221抑制剂组（Tansfection of miR-221inhibitor）②阴性对照组(Negative control)③控制组（Control），分别转染48h后，采用RT-PCR、western-blot技术检测MMP-9、MMP-2、VEGF-C的mRNA、蛋白的表达变化。用transwell检测细胞侵袭性的改变。结果：1.转染miR-221抑制剂促进人膀胱移行细胞癌T24、5637、J82细胞发生凋亡①用5.0μl lipo2000包裹100nM miR-221抑制剂或Negative control FAM分别转染T24、5637、J82细胞，5h后荧光显微镜下观察结果示：转染效率均接近80%，符合后续实验要求。②转染24h、48h、72h后，MTT结果示：miR-221抑制剂对3株细胞的实验组细胞增殖活性均出现不同程度的降低，其抑制率也相应的升高，且具有时间依赖性，阴性对照组和控制组比较，细胞增殖活性和抑制率并无明显变化；虽然转染72h后，细胞抑制率高于48h，但转染72h后，细胞量较少，难以满足后续RNA、蛋白提取等实验要求，故选转染48h进行后续实验。③转染48h后，qRT-PCR检测miR-221表达结果示：3株细胞实验组miR-221表达水平与阴性对照组、控制组比较明显下调，差异具有统计学意义（P0.05），且J82细胞下调最为明显，阴性对照组与控制组比较无明显差异，此结果说明，转染miR-221抑制剂48h后，确实有效的抑制了3株细胞内miR-221表达。④转染48h后，RT-PCR、western-blot结果示：3株细胞实验组促凋亡基因PUMA、Bax的mRNA和蛋白表达与阴性对照组、控制组比较明显上调，而抗凋亡基因Bcl-2的mRNA和蛋白表达与阴性对照组、控制组比较明显下调，差异均具有统计学意义（P0.05），阴性对照组与控制组比较无明显差异。⑤流式细胞术结果示：3株细胞实验组早期晚期凋亡率与阴性对照组、控制组比较明显上调，差异均具有统计学意义（P0.05），阴性对照组与控制组比较无明显差异；三株细胞之间比较可发现5637细胞早期晚期凋亡率较T24、J82细胞低。⑥AO-EB染色结果示：3株细胞实验组发生早期凋亡细胞和晚期凋亡形态学改变的细胞数量与阴性对照组、控制组比较明显增多，阴性对照组与控制组比较无明显差异；而5637细胞与T24、J82细胞比较，发生早期凋亡细胞和晚期凋亡形态学改变的细胞数量较少，这与流式细胞术结果基本一致；而阴性对照组与控制组比较无明显差异。1.转染miR-221抑制剂后可降低人膀胱移行细胞癌T24、5637、J82细胞侵袭性①转染48h后，RT-PCR、western-blot结果示：3株细胞实验组MMP-9、MMP-2、VEGF-C的mRNA和蛋白表达水平与阴性对照组、控制组比较明显降低，差异均具有统计学意义（P0.05），阴性对照组与控制组比较无明显差异。②transwell结果示：3株细胞实验组透过基质胶膜的细胞数量与阴性对照组、控制组比较明显减少，差异均具有统计学意义（P0.05），而阴性对照组与控制组比较透过基质胶膜的细胞数量相当。结论：1、miR-221抑制剂可有效抑制人膀胱移行细胞癌T24、5637、J82细胞内miR-221的表达。2、miR-221抑制剂可以抑制人膀胱移行细胞癌T24、5637、J82细胞的增殖。3、miR-221的下调可促使人膀胱移行细胞癌T24、5637、J82细胞内PUAM基因表达上调，进而上调促凋亡基因Bax和下调抗凋亡基因Bcl-2表达，从而促进细胞发生凋亡。4、miR-221的下调可促使人膀胱移行细胞癌T24、5637、J82细胞内的MMP-9、MMP-2、VEGF-C表达下调，从而使膀胱癌T24、5637、J82细胞的侵袭力下降。5、膀胱癌细胞内高表达miR-221可促使膀胱癌细胞具有凋亡抗性，进而促进膀胱癌细胞发生免疫逃逸。