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蛋白质磷酸化是一种非常重要的翻译后修饰,它直接或间接地参与细胞内几乎所有重要生物学过程。但是蛋白质磷酸化修饰具有低丰度、不稳定性、不均一性等不利于蛋白质磷酸化位点鉴定的生物学特性,使得功能磷酸化蛋白质组学研究面临巨大挑战。为了克服这些局限性,本工作在磷酸化肽段富集、磷酸化位点的验证以及定量方面做了深入的探索；成功地开发了一些新的方法并将这些新方法应用到糖尿病的磷酸化蛋白质组学研究中。
本工作的第一部分主要是开发一种新的、更加全面的磷酸化肽段富集方法。目前国际上已经报导了一系列不同的基于亲和相互作用的磷酸化肽段富集策略,但是每一种富集策略都存在它的特异性和偏好性,只能富集某一类磷酸化肽段。因此对磷酸化肽段进行全面的富集在技术上仍然是一个很大的挑战。在本工作中,首先证明了基于在线连续pH梯度的强阴离子交换色谱方法(SAX方法)与基于二氧化钛(TiO2)富集的方法具有高度的互补性。另外,发现不管是SAX还是强阳离子交换色谱(SCX)的流穿组分中都含有丰富的磷酸化肽段的信息,需要进一步进行分级分析。通过结合这两种高度互补的磷酸化肽段富集策略,我们发展了一种基于强阴离子交换色谱和二氧化钛色谱的更加全面的磷酸化肽段富集策略(AFET方法)。它既能对碱性和单磷酸化肽段进行富集,又能对酸性和多磷酸化化肽段进行富集。通过这种方法,本工作在HeLa细胞样品中取得了很好的磷酸化肽段富集效果。与其它方法比较发现,这种方法具有耗时少,实验步骤更简单,自动化程度更高等优点。
本工作的第二部分主要对GK大鼠肝脏细胞核组分进行大规模的磷酸化富集分析,并结合磷酸酯酶处理和定量蛋白质组学策略对磷酸化修饰进行了验证。在这部分工作中,通过强阴离子交换色谱和强阳离子交换色谱技术对GK大鼠肝脏细胞核进行了大规模蛋白质磷酸化分析,最终鉴定了1,885(Ascore p≤0.01)个非常确信的磷酸化修饰位点,定位于900个蛋白质上。然后,使用碱性磷酸酯酶处理结合iTRAQ标记的定量蛋白质组学策略对该磷酸化数据进行大规模的验证,40％以上的磷酸化肽段被验证,结果显示本工作获得了一个非常高可信度的磷酸化数据集。蛋白质序列分析显示磷酸化位点主要位于酸性氨基酸富集的区域。此外,发现大鼠的磷酸化位点在高等动物中是高度保守的,而在低等生物中,是相对不保守。进一步分析发现在低等生物中,不保守的磷酸化位点主要发生拟磷酸化突变,而在高等生物中,主要发生中性突变。
本工作的第三部分主要是对iTRAQ方法的优化及其在复杂样品中的应用。同重元素标记的、多元的蛋白质相对和绝对定量方法(iTRAQ)主要通过二级图谱中的报告离子强度来进行定量。由于离子阱质谱具有检测低分子质量端的限制,因此iTRAQ这种定量标记方法一直不能应用于离子阱质谱来进行分析。脉冲碰撞解离(PQD)技术的出现使得离子阱质谱对iTRAQ标记的肽段进行定量分析成为了可能。在本工作中,首先优化了PQD的各个参数,以便检测到更高的报告离子强度。同时发现碰撞诱导解离(CID)和PQD解离方式在iTRAQ定量方法中具有很强的互补性,PQD能检测用于定量分析的报告离子,但碎片效率比较低,而CID能产生更加丰富的碎片信息。因此我们结合这两种互补的二级碎裂模式(PQD-CID模式)对复杂样品进行分析,结果发现这种PQD-CID分析模式在获得定量信息的同时,大大提高了肽段的鉴定,特别是对iTRAQ标记的磷酸化肽段的鉴定。最终,把建立好的iTRAQ定量方法应用到糖尿病的研究中,对糖尿病大鼠与正常大鼠的肝组织进行了定量分析,找到了一些蛋白质在表达水平和磷酸化修饰水平上的差异,这对研究糖尿病的发病机制以及寻找糖尿病的生物标志物都有非常重要的意义。