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在现代药物开发的过程中，高通量筛选(HTS)是发现活性化合物的主要方法。通过对活性化合物的作用机制和构效关系(SAR)的深入研究，可以开发出先导化合物和候选药物。本论文利用酶动力学、蛋白质结晶学等方法研究了高通量筛选得到的一类Caspase-3抑制剂异喹啉-1，3，4-三酮衍生物的分子机制，并结合肾小球上皮蛋白质1(Glomerular epithelial protein1，GLEPP1)抑制剂高通量筛选模型的筛选结果，探讨该机制在高通量筛选中的普遍性。
论文的第一部分工作是对Caspase-3小分子抑制剂异喹啉-1，3，4-三酮衍生物的作用机理的研究。Caspase-3是治疗细胞凋亡过度导致的阿尔海默症、亨廷顿综合症、自身免疫疾病等的重要靶点。许多药物开发项目致力于Caspase-3抑制剂的探寻。我们以前的研究发现，异喹啉-1，3，4-三酮衍生物能有效地抑制Caspase-3的活性。酶动力学的研究表明异喹啉-1，3，4-三酮衍生物以慢结合、不可逆的方式抑制Caspase-3的活性。进一步的研究发现，异喹啉-1，3，4-三酮衍生物对Caspase-3的抑制作用依赖于二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)和氧气的存在，提示氧化还原循环可能参与了该类化合物的抑制作用。使用化学指示剂H2DCFA的检测表明，在DTT存在下，异喹啉-1，3，4-三酮衍生物能够生成活性氧(ROS)。电子自旋共振(ESR)实验，也佐证了ROS的产生。我们研究中还发现，体内含二巯基的还原型硫辛酸却能够比DTT更强的促进异喹啉-1，3，4-三酮衍生物生成氧自由基，也更强的增进该类化合物对Caspase-3的抑制作用。然而，单巯基还原剂β-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽(GSH)等不能促进异喹啉-1，3，4-三酮衍生物生成氧自由基，也不能影响该类化合物的对Caspase-3的抑制活性。进一步的研究表明，ROS清除剂过氧化氢酶和超氧化物歧化酶(SOD)可以阻断异喹啉-1，3，4-三酮衍生物对Caspase-3的抑制，暗示氧自由基参与该类型的化合物对靶蛋白的抑制作用。在我们得到的4个异喹啉-1-3-4-三酮衍生物与Caspase-3共结晶的晶体结构中，Caspase-3活性中心半胱氨酸的巯基已经被氧化成了磺酸基，进一步证明了氧化还原作用参与异喹啉-1-3-4-三酮衍生物对Caspase-3的抑制。基于以上的生化数据和结构分析，我们认为二巯基试剂(如DTT或还原型硫辛酸)依赖的氧自由基生成是异喹啉-1-3-4-三酮衍生物抑制Caspase-3活性的分子基础。该Caspase-3抑制剂分子机制的阐述，对研究细胞凋亡机制以及开发新的Caspase-3抑制剂都有积极意义。
论文的第二部分工作是对肾小球上皮蛋白质1(Glomerular epithelial protein1，GLEPP1)抑制剂的高通量筛选模型和对筛选到的生成氧自由基的化合物的分析。GLEPP1是受体型蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTPase)家族中的成员，通过胞内部分的单个催化结构域调控靶蛋白的磷酸化水平，从而改变细胞中其它蛋白分子的活性。GLEPP1在炎症诱发的肾小球损伤、肺癌等许多疾病的病理过程中起着重要的作用，寻找高效、高选择性GLEPP1抑制剂，将为治疗和研究相关疾病提供新的可能和方法。我们建立了GLEPP1小分子调节剂的高通量筛选模型，完成了对国家新药筛选中心化合物库中的67472个样品的高通量筛选。对GLEPP1高通量筛选模型得到的阳性化合物的分析表明，三分之一左右的化合物是通过与DTT反应生成活性氧而抑制靶酶的活性。这些小分子化合物，不但对蛋白酪氨酸磷酸酶的其它成员以及Caspase-3有抑制活性，而且对不以Cysteine为活性中心的蛋白激酶IKKβ也有抑制活性。这些结果说明，一方面，化合物库中广泛存在着能够DTT依赖的生成氧自由基的化合物；另一方面，这类化合物可能影响很多药物靶点的高通量筛选。即DTT依赖的自由基生成是高通量筛选中非特异性抑制的一种普遍机制。因此，我们基于以上研究结果发展了鉴别和避免该类型化合物的简明方法，以利于未来的高通量筛选和新药研发。
综上所述，我们通过对Caspase-3小分子抑制剂异喹啉-1-3-4-三酮衍生物的作用机理的研究，揭示了该类化合物通过与二巯基试剂(如DTT)反应生成氧自由基(ROS)而抑制靶酶的活性。在高通量筛选体系中，DTT作为还原剂被广泛应用于保护靶蛋白免于氧化失活。然而，对蛋白质酩氨酸磷酸酯酶GLEPP1高通量筛选结果的分析，证实DTT依赖的氧自由基生成是高通量筛选中非特异性抑制的一种普遍机制。这些小分子化合物的分子作用机制的阐明，不仅对于开发新的Caspase-3和GLEPP1的小分子调节剂具有积极的参考价值，而且对于未来的高通量筛选和新药研发都具有重要的现实意义。