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毒死蜱[chlorpyrifos, O, O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯],商品名为毒死蜱、乐斯本等,1965年由Dow Chemical Company推广使用的一种高效杀虫剂,在世界范围内广泛应用于经济作物的害虫防治,是目前替代高毒有机磷杀虫剂的主要品种之一,也是安全农产品农药残留监控的重要品种,但广泛过度使用,将造成食品、环境污染,对人畜将造成严重危害在粮食等作物上引起的残留问题已有所报道,因此对食品,水和环境的有机磷农药残留的检测,对于维持人们的身体健康是非常重要。我们建立了一种新型灵敏快速的化学发光免疫分析方法,用于土壤,饮用水,果蔬中毒死蜱残留的检测。以毒死蜱、鲁米诺和BSA为标记模型,研究了标记顺序对发光强度的影响,并对标记物进行了纯化鉴定,同时评价了标记物的光学性质和免疫性质,在此基础上,建立了检测有机磷农药毒死蜱残留的均相化学发光免疫分析新方法,论证了多标记均相化学发光免疫分析法的可行性。1.以新型有机磷农药毒死蜱为目标农药,在碱性条件下与3-巯基丙酸加热回流反应,使毒死蜱分子吡啶环上第6位氯原子通过亲核取代反应被3个直链碳原子的3-巯基丙酸取代,从而引入羧基基团(-COOH)。采用柱层析纯化产物,洗脱液为正己烷-乙酸乙酯-乙酸(70：30：1),纯化后的产物分别通过紫外光谱、红外光谱、薄层色谱以及熔点来分析与鉴定。结果表明,改造后的毒死蜱在紫外吸收的最大吸收峰均发生了明显的变化,并且在红外光谱处1708.64 cm-1出现了强烈的吸收峰,其熔程是120-125℃,纯化后的产物在薄层板上只呈现一个点,可以证明改造过程是成功的,成功地在毒死蜱分子中引入了羧基基团。2.在合成毒死蜱化学发光标记物时,有两种标记顺序。方案一是先将改后的毒死蜱既毒死蜱衍生物偶联到BSA上,得到BSA-毒死蜱共轭物,然后将鲁米诺标记到BSA-毒死蜱共轭物上；方案二是先将鲁米诺标记到BSA上,合成鲁米诺-BSA共轭物,然后将改造后的毒死蜱偶联到鲁米诺-BSA共轭物上。通过对两种不同标记方法得到的产物进行标记率、稳定性和其发光效率的评价来选择最佳方案。结果表明第一种方案中鲁米诺：BSA：毒死蜱偶联比为22：1：14,平均相对发光强度为26343,稳定性好,因此选择第一种方法作为最佳标记方案。3.通过对化学发光标记物的一系列评价,来确定标记物的各方面指标能否成功用于实际检测中。首先对标记物通过SephadexG-25色谱柱进行了纯化,并且对标记物进行SDS-PAGE电泳的纯度鉴定。然后对标记物化学发光光学性质和荧光光学性质,稳定性及其免疫学性质进行了评价。结果表表明,在最优pH值条件下,采用H2O2体系发光反应,标记物能在6s时达到最大发光强度,发光检出限为9.15 ng/mL.通过初步的抑制性免疫竞争反应,毒死蜱标记物能与未标记的毒死蜱强烈地竞争同源抗体,表明该标记物可以用于毒死蜱残留的化学发光免疫分析检测。4.通过对发光条件和免疫条件的优化选择,建立了有机磷农药毒死蜱残留的均相化学发光免疫分析新方法,该法线性范围7.0 ng/mL～100.0 ng/mL,相关系数系为0.9946,检出限为2.35 ng/mL,样品添加回收率在87.7%～104%,批内变异系数小于8%,批间变异系数小于20%,交叉反应率小于5%,实验结果表明,本文提出的用于检测农药的多标记均相化学发光免疫分析方法是可行的。