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禽流感病毒是正粘病毒科，单股负链的RNA病毒。近年来，禽流感陆续在我国禽类和野鸟中暴发，给养禽业造成了惨重的损失。一些高致病性禽流感病毒，尤其是H5N1禽流感病毒有时感染人类并可以致死、人感染H5N1禽流感病毒的事件持续发生，造成人们严重的恐慌。其他亚型的流感病毒，如H1，H3，H9型，对生产和生活中的带来的危害也不容忽视。由于流感病毒结构的特征，使得抗原漂移和突变频频出现。加上流感病毒亚型多，使得疫苗的开发和生产速度远远赶不上流感病毒的突变速度。单纯靠疫苗很难完全控制疫情；目前用于治疗流感病毒的药物，如金刚烷胺、金刚乙胺等，临床毒株耐药性也日益严重，因此寻找新型高效的抗流感药物对预防流感十分重要。我国的中药资源丰富，且中医药在我国预防流感有着悠久的历史。近年来，有关中药具有抗病毒活性的文章屡屡报道，然而，中药的成分、作用机制等依然不清楚，严重困扰着中药的推广和发展。 石蒜在我国民间早已有了广泛的应用基础，其主要药效成分为石蒜鳞茎部的十多种生物碱。据报道石蒜碱具有镇痛、降压、抗炎、抗病毒的作用。但关于抗流感病毒的研究还没有报道。本研究以石蒜鳞茎为原料，运用各种色谱技术，分离出十五种石蒜碱型生物碱化合物，通过光谱和化学方法对分离得到的化合物进行结构鉴定。本研究旨在评价石蒜生物碱化合物体外抗流感病毒活性，探讨其作用机制。利用MDCK(犬肾细胞)细胞筛选模型评价这这些石蒜生物碱化合物对各种亚型流感病毒A/Chicken/Guangdong/178/04(H5N，178)，A/DuckGuangdong/212/04.(H5N1，212)，A/swine/Guangdong/166/06(H3N2，166)，A/Chicken/Henan/170/03(H1N1，170)，A/Puerto Rico/8/34(H1N1，PR8)，A/Chicken/Guangdong/400/07(H9N2，400)，A/Chicken/Guangdong/228/04(H9N2，228)进行了抗病毒活性检测。通过先加药后接种病毒、药物与病毒体外作用2 h后接种细胞、感染病毒同时加药及感染病毒后加药四种处理方式，研究石蒜生物碱化合物对流感病毒的抑制作用，推测其作用方式。试验结果表明，lycorine(AA1)，hippeastrine(AA2)，haemanthamine(AA3)和11-hydroxyvittatine(AA4)显示出了抗病毒活性且药物发挥其功效在流感病毒进入到细胞内。检测了活性药物的基本指数，半数毒性量CC50，半数有效量EC50值及选择指数SI。 为了进一步研究这四种石蒜生物碱单体的抗流感病毒活性，本研究通过7种不同的给药方式及不同时间点给药进行了分析。结果表明：七种不同给药方式及不同时间点给药显示，化合物AA1，AA3的抗病毒活性较高，这些单体抗病毒活性主要发挥在病毒进入细胞内；，这四种单体发挥抗病毒活性主要在病毒复制的早期阶段，AA1在流感病毒复制的单个周期内加入均能很好的抑制病毒，从而检测不到病毒的滴度。AA3在流感复制的4小时内给药均能发挥很好的抗病毒活性。 为了进一步研究这四种石蒜生物碱单体抗流感病毒的机制，利用体外药物对子代病毒增殖的影响试验、详细的不同时间点试验，研究四种活性药物抗流感病毒的作用机制。选择活性较高的药物AA1，AA3，利用GD178 H5N1病毒感染MDCK细胞模型，对血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和病毒RNP(核糖核蛋白)聚合酶的抑制活性来探索体外药物抗病毒的作用靶点；借助假病毒系统检测活性药物是否对病毒的进入过程有抑制作用；通过对流感病毒的NP蛋白进行核内定位，探讨药物对病毒早期复制的关键蛋白的影响；通过对流感复制过程中mRNA水平的检测，探讨药物在病毒复制的mRNA水平的影响。结果表明：石蒜生物碱AA1，AA3不能抑制流感病毒的HA蛋白与NA蛋白活性；利用假病毒系统发现AA1，AA3石蒜生物碱单体不能抑制病毒侵入宿主细胞这个过程；通过构建反转录载体，利用微基因组(minigenome)分析方法分析这两个石蒜生物化合物对RNP复合物活性(病毒的复制，致病性重要的遗传物质)的影响，结果发现该石蒜生物碱单体对RNA聚合酶活性没有明显影响；通过mRNA水平的检测发现药物在病毒复制的早期阶段对病毒复制的早期和晚期的基因(NP基因和M1基因)有很强的抑制作用；通过激光共聚焦将NP蛋白进行定位分析发现，AA1，AA3石蒜生物碱单体在流感病毒复制过程中抑制RNP复合物从细胞核的输出从而导致病毒的复制无法正常进行。 基于以往关于石蒜碱抗肿瘤，抗白血病等活性的研究发现，石蒜生物碱有较强的抑制细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡的机制。本研究从细胞的角度分析药物可能的作用机制。从本研究中发现，通过显微镜的观察，药物培养的接毒细胞与空白细胞的形态一样，但是细胞数量比空白细胞少，且该浓度的药物对细胞没有毒性(WST-1法)，即药物发挥抗病毒活性是通过影响细胞的生长速度而不是细胞毒性实现的。 流感病毒的侵入会导致宿主细胞的微管、微丝发生巨大变化，细胞的生长周期会随着病毒适应的速度而改变。本研究中发现药物处理的细胞微管微丝和空白对照细胞相比没有太大差别，但攻毒组的细胞的骨架成分减少较多；通过细胞周期的检测，显示攻毒后的细胞S期明显增多，经药物处理后，该期的细胞会下降。子代病毒的释放需要细胞凋亡这一重要环节来实现，通过对细胞凋亡的检测发现，分别用AA1，AA3石蒜生物碱化合物处理后细胞的早期凋亡细胞的比例明显下降。 综合各试验结果：石蒜生物碱化合物AA1，AA2，AA3，AA4在体外具有抗流感病毒的作用，且对不同亚型的抗病毒效果差异较大，以H5型的效果最好。这种不具有血清型特异性的抗病毒活性的特性，提示药物作用的靶点很可能在细胞上。以病毒复制的整个过程来探索药物可能作用的靶点，结果显示均无找到可疑靶点，但发现药物抑制病毒RNP无法出细胞核致使病毒的复制无法顺利进行。以细胞角度分析药物可能的作用靶点，实验结果显示药物抑制病毒引物的细胞凋亡，减慢细胞的生长速度，保护细胞骨架的重组来发挥抗流感病毒的活性。