褐飞虱NlBic-C基因功能分析

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水稻是我国乃至全球最重要的粮食作物,而褐飞虱是我国大多数稻区最主要的害虫,是我国水稻产量严重减产的主要原因。生殖和繁衍是褐飞虱大爆发、危害水稻的前提,而雌虫在昆虫的繁衍过程中起着至关重要的作用。雌虫生殖行为的产生、卵巢的发育、形成卵母细胞及营养物质、交配、卵孵化率、幼虫成活情况等因素都对褐飞虱的致害能力有极大的影响。果蝇中Bicaudal-C(Bic-C)基因的功能与胚胎发育有关,Bic-C是RNA结合蛋白,它的缺少会导致果蝇胚胎滤泡细胞的错误迁移、头部的缺失和双尾结构。在线虫中Bic-C控制生殖系细胞发育及性别决定,在爪蟾中Bic-C控制内胚层形成,在小鼠中还发现Bic-C影响的肾脏等器官的正常形成。然而,Bic-C在不完全变态昆虫中的功能还不清楚。  本研究从褐飞虱基因组和转录组分析中得到NlBic-C的序列,NlBic-C的ORF长2205bp,编码734个氨基酸的多肽,预计分子量为80.1 kDa,氨基酸同源性比对发现,NlBic-C并不保守,且在N端含有2个KH结构域,在C端含有一个SAM结构域。通过实时荧光定量PCR,我们确定了NlBic-C基因是雌虫特异表达基因,从五龄若虫期开始表达,在羽化第三天表达量最高。不同组织实时荧光定量PCR实验显示,NlBic-C主要表达于卵巢,且主要表达于正在发育的卵母细胞。原位杂交实验也证实了NlBic-C主要在卵母细胞表达。但在产出的卵中没有检测到该基因表达,表明NlBic-C可能主要在卵母细胞发育和成熟过程中起作用,而与果蝇的Bic-C控制胚胎发育过程不同,NlBic-C可能不在胚胎发育过程中发挥功能。对五龄若虫每头显微注射0.5ng的NlBic-C dsRNA,成虫期进行qRT-PCR检测表明RNAi效果很好,NlBic-C的mRNA显著下调。雌性褐飞虱被干扰后外形没有可见变化,但卵巢发育不良,产生黯淡、畸形的卵母细胞甚至不产生卵母细胞,产卵量和孵化量显著下降,绝大多数失去生殖能力。细胞凋亡(TUNEL法)检测显示雌性褐飞虱被干扰后卵巢细胞和卵母细胞没有进入凋亡,而免疫组化实验显示NlBic-C被RNA干扰后卵母细胞对卵黄蛋白的摄取受到了抑制。进一步用不同梯度浓度的NlBic-C dsRNA处理五龄若虫,结果表明褐飞虱NlBic-C基因对RNAi非常敏感,每头若虫用0.05pg的NlBic-CdsRNA处理,就会对雌虫卵母细胞发育产生明显影响,每头若虫5pg就能使正常卵母细胞形成数量降到对照处理的50%以下。本研究结果不仅扩展了我们对昆虫Bic-C功能的认识,对利用基于RNAi技术防治褐飞虱的研究都具有很大的潜在价值。
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