猪精原干细胞长期培养与转基因

• 作 者: 白银山
• 机 构: 华南农业大学
• 出 处: 华南农业大学
• 发表日期: 2011年期
• 关键词: 猪精原干细胞 分离鉴定 长期培养 转基因猪

精原干细胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性动物体内唯一可将遗传信息传递给子代的干细胞。它具有多潜能性，可以通过直接诱导获得多功能干细胞(Induced pluripotent stem cells，IPS细胞)。在生命科学基础理论研究和转基因动物生产中具有重要应用价值。但是目前猪精原干细胞(Porcine spermatogonial stem cells，PSSCs)体外培养体系尚未建立，而且其表面分子标记物和增殖分化调控机制也尚未明确，这严重制约了PSSCs的研究与应用。　　
本研究旨在建立PSSCs的分离和长期培养技术体系，并初步进行PSSCs的转基因研究，以期为建立精原干细胞介导的转基因猪生产技术奠定基础。以1～5d长白仔猪为细胞来源，进行了猪SSCs的分离、培养、分子特征鉴定以及转基因等研究，取得了以下试验结果：　　
1.通过对比猪支持细胞饲养层(Porcine Sertoli Cell，PSTO)和猪胎儿成纤维细胞饲养层(Porcine Embryonic Fibroblast，PEF)对PSSCs增殖分化的影响，发现在只添加LIF因子培养体系中，PSTO比PEF更有利于促进PSSCs增殖。　　
2.通过比较三种分离方法(机械法、一步酶法和两步酶法)对体外培养PSSCs增殖的影响，发现一步酶法获得PSSCs的增殖能力较高、机械法操作简单、两步酶法可以得到单一的PSSCs，但PSSCs增殖能力比较低。　　
3.在筛选培养体系时，通过比较三种培养基(DMEM、DMEM/F12和α-MEM)和三个血清浓度(5％、10%和15%)对PSSCs增殖的影响，发现DMEM和15%血清最有利于PSSCs体外增殖；同时也证明了CD29(βi整合素)有促进PSSCs增殖的作用；在睾丸细胞共培养体系中，通过MMC(Mitomycin C，MMC)抑制PSTO生长，显著地提高PSSCs增殖效果。　　
4.通过RT-PCR分子检测和免疫荧光检测证明PSSCs表达了Oct3/4、Sox2、Nanog、C-myc、Klf-4、Prdm-14和CD29等干细胞重要的多能性基因。　　
5.通过添加化学小分子来诱导PSSCs，使PSSCs在体外长时间保持了未分化状态，长达86d；在模拟微重力三维培养中，PSSCs维持未分化状态达29d。　　
6.使用脂质体转染法和慢病毒转染法都成功地将GFP基因转入PSSCs里，但是总体效率还很低，未能筛选建立阳性的PSSCs细胞系。